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  • 發布時間:2020-09-01 13:22 原文鏈接: RFLP技術和RAPD技術3

    一個較為詳細的遺傳連鎖圖譜不僅對該物種的遺傳學基礎研究有重要意義,同時對該物種的育種研究也很有幫助。Potlethwait和Stephen 等用RAPD技術進行斑馬魚遺傳連鎖圖譜的制作。Liu把RAPD技術應用到鯰魚基因圖譜研究中。孫效文等建立了鯉魚的遺傳連鎖圖譜。圖譜有RAPD分子標記56個,鯉魚的SSLP標記26個,鯽魚的SSLP標記有19個,斑馬魚的SSLP標記有70個,鯉魚基因標記91個,圖譜有50個連鎖組,連鎖圖給出鯉魚的基因組大小在5789cm左右。

    2.2確定種、品種間的親緣關系

    種群親緣關系的傳統研究方法是從形態學、細胞學、生化指標等方面進行,但受個體和環境的影響較大,有時不能反映物種本身所固有的特征。物種基因組的組成在RAPD圖譜上得到體現,親緣關系越近,基因組中的同緣序列越多,則以相同引物擴增出的共有標記也就越多。因此,RAPD技術與傳統方法結合是研究物種親緣關系的有效手段。對不同種、同種不同群體的DNA進行RAPD分析,篩選出特征性條帶,計算相似系數和遺傳距離,從而可確定它們的親緣關系。李思發等用RAPD技術研究中國沿海六水系絨螯蟹(中華絨螯蟹和日本絨螯蟹)群體的親緣關系,從48個引物中篩選出2個具有群體特異性的引物,其中Z2擴增的 880bp片段為珠江蟹和南流江蟹兩群體所共有,擴增的700bP片段為長江蟹、黃河蟹、遼河蟹、甌江蟹四群體所特有。這可作為區別中華絨螯蟹(長江蟹、黃河蟹、遼河蟹、甌江蟹)和日本絨螯蟹(珠江蟹、南流江蟹)的分子遺傳標記。用RAPD技術對中國沿海六水系絨螯蟹進行兩大類型劃分與生化遺傳差異分析、形態特征多元分析的結果一致。宋林生等用RAPD方法研究對蝦屬六個種間的親緣關系,用20個隨機引物擴增,共得到364條清晰穩定的多態性片段,根據擴增片段的共享度計算相對遺傳距離指數,然后用UPGMA和NJ等聚類方法對其進行分析,構建系統樹,確定了它們之間的親緣關系。聚類分析的結果為:中國對蝦、長毛對蝦和墨吉對蝦三者的關系最近,它們首先聚類在一起,然后與斑節對蝦聚在一起,最后是南美白對蝦和日本對蝦。從其結果可以看出,外部形態比較相似的種類在基因組DNA上表現出較大的相似性,反之則較小。宋林生等用RAPD方法研究六種海產蝦類基因組DNA多態性,結果顯示六種蝦的親緣關系與傳統的分類結果基本一致。謝浩等用RAPD方法研究三種絨螯蟹的親緣關系,用一組引物對每種各10個個體的基因組DNA進行擴增,得到一批特異、可重復的擴增圖譜。擴增區帶相似串的分析結果表明,中華絨螯蟹與日本絨螯蟹的親緣關系較遠,而南流江的絨螯蟹(合浦亞種)與日本絨螯蟹較近。

    Borrwsky等用隨機引物擴增產物重新構建了脊椎動物DNA指紋圖。Sultman等用DNA標記對麗魚科魚類的系統發育進行了研究。何舜平等運用RAPD的方法對五種鯉科魚類進行了分析,并論述了鮈鯽的系統位置。何舜平等通過對鯉科魚類的隨機擴增,獲得了大量有系統發育信息的DNA多態片段,并繪制了低等鯉科魚類代表屬種的分支系統圖。夏德全等用RAPD方法分析太湖大銀魚、太湖新銀魚和寡齒新銀魚的親緣關系,同時發現有個別樣品的核基因組與太湖中已有的幾種銀魚有顯著差異。鄒曙明等用RAPD方法研究草魚、柏氏鯉和3個地理種群鯉的親緣關系,研究結果支持中國東部魚類具有雙重來源性的觀點。

    2.3特定基因的標記

    利用DNA分子水平上的變異作為遺傳標記進行基因標記已成為可能。周開亞等用RAPD方法研究鑒別中華絨螯蟹種群,用200個隨機引物對中華絨螯蟹遼河種群、長江種群和甌江種群進行RAPD分析,其中引物HX01和HX02檢測到甌江種群和遼河種群所有樣品共有HX01—0.4和HX02—0.7擴增片段;而長江種群樣品的PCR反應中無這兩個擴增片段出現,因而可作為長江種群的鑒別標記。未發現可區分甌江種群和遼河種群的標記。謝浩等用RAPD方法研究三種絨螯蟹的親緣關系,用引物OPO—05對25個中華絨螯蟹個體、27個日本絨螯蟹個體及12個日本絨螯蟹合浦亞種個體擴增,發現中華絨螯蟹所有個體都能擴增出一條大小約為1kb的區帶,且相當明顯和穩定,而其它兩種在相同條件下僅有個別個體能擴增出相當微弱的區帶。因此,可將這一區帶作為一個遺傳標記,用于鑒別中華絨螯蟹與日本絨螯蟹及其合浦亞種。
    目前RAPD已廣泛應用于鑒別、鑒定不同的生物種類。Johnson用RAPD技術鑒定了不同實驗室品系的斑馬魚。薛國雄對長江、珠江、黑龍江三大水系的草魚產卵場及太湖中捕撈的草魚進行覆蓋性的RAPD分析,結果表明每一水系的草魚種群均有其特征性基因圖譜,可作為種群鑒定的依據。夏德全等應用該技術檢測了一個奧利亞羅非魚養殖群體和湘湖,美國和沙市三個尼羅羅非魚養殖群體,獲得了鑒別尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚的分子遺傳標記。姚紀花等利用20個隨機引物對產于方正、彭澤和淇河地區的三個銀鯽種群進行了RAPD檢測,也獲得了銀鯽種群鑒定的分子標記。鄧懷等對青魚、草魚、鰱魚、鳙魚、鯽魚、鯉魚、團頭魴、胭脂魚、土鯰和黃顙魚進行了RAPD—PCR擴增。結果顯示RAPD是一種非常靈敏的種間鑒定技術,特別是對魚卵和魚苗的鑒定有重要意義。鄭光明等以池養的鯪、麥鯪為材料,提取血液基因組DNA,利用隨機引物進行PCR擴增,通過縮短擴增時間和電泳時間,快速鑒定了三種不同的鯪魚,并建立了一套 DNA分子水平上的快速鑒定魚種的方法。

    2.4識別同一物種的性別差異

    蝦、蟹的性染色體沒有統一的模式,用常規核型分析方法不能鑒別性染色體。通過RAPD技術可找出同一物種不同性別的基因組DNA特征性條帶,從而有助于研究性別控制機制,也可為性別確定提供分子依據。邱濤用RAPD技術識別中華絨螯蟹的性別,200個引物中有17個引物擴增出群體水平的差異,其中一個引物(OPM14)擴增出個體水平的差異:雄性有一個800bP的特異帶,而雌性沒有。這可作為有價值的性別鑒別標記。

    2.5監測遺傳滲入,維持物種遺傳多樣性

    目前,人為的養殖活動、人工放流等使得蝦、蟹類種內不同種群間非自然的遺傳滲入已相當普遍,應引起重視,需加以監測并收集數據,為保護種質資源、維持物種遺傳多樣性提供依據。李思發等用RAPD指紋標記研究中國大陸六水系絨整蟹的親緣關系,引物OPP17擴增的947bP片段的出現頻率,在長江、黃河、遼河三群體中顯著地從南到北遞減,長江蟹87.5%、黃河蟹41.66%、遼河蟹10.83%。這一遺傳滲入的度量可作為區別三水系中華絨螯蟹的判據。邱濤等用RAPD方法研究中華絨螯蟹長江、遼河、甌江水系三群體的遺傳多樣性,并未發現三群體間存在特征性條帶,但群體間差異大于群體內差異。未發現群體間的分子遺傳標記,但三群體間確實存在差異,表明近來種質資源混雜,遺傳滲入是其中原因之一。

    RAPD標記可用于群體遺傳學研究,檢測種群內、種群間的遺傳多樣性水平,并為種群識別提供可靠的遺傳標記。Bardakci等用RAPD技術評估了羅非魚的種群內、種群間的遺傳變異度。Bielawski等進行了太平洋海岸條斑鱸的RAPD分析。Caccone等對歐洲尖吻鱸的DNA多態性進行 RAPD—PCR分析。Garcia等嘗試在斑節對蝦中用RAPD分析不同地理群體間的遺傳多態性,并就其在蝦類選育中的應用作了初步探討。王繞梅等用 RAPD技術檢測野生鯽魚和四個金魚代表種的基因組DNA多態性。張德春用該技術對湖北、廣西兩個鰱魚人工養殖群體進行了遺傳多樣性的比較研究,為鏈魚人工繁殖的科學規范提供一定的理論依據。張四明等進行了中華鱘隨機擴增多態性DNA及遺傳多樣性研究,結果顯示中華鱘天然群體核DNA水平的遺傳多樣性較低,從而為中華鱘資源的監測和保護提供了理論依據。石拓等用該技術對中國對蝦朝鮮半島西海岸群體的基因組DNA多態性進行了檢測,表明該對蝦群體的遺傳多樣性水平較低。宋林生等對日本對蝦野生群體和養殖群體的遺傳結構的RAPD標記進行了初步的研究,并認為將RAPD以及其他分子標記技術用于海洋動物的育苗育種中,進行標記輔助育種,是海洋動物增養殖健康發展的有力保證。


    RAPD技術程序簡單快捷,且無需事先確定目的基因的序列,無種屬特異性,有無數的引物可供利用,能產生足夠的多態性,無需同位索,可以鑒別物種之間和種群之間的基因組的差異,也可區分個體之間的差異。為此,許多從事水產育種工作的科研人員已把RAPD技術應用到水產遺傳育種上,并已取得—定的成果。在海水魚類(如大黃魚等)、海水蝦類的種質資源研究中,由于同工酶所揭示的種內水平上的遺傳差異水平非常低,而RAPD比同工酶更能指示DNA多態性,因此RAPD分子標記在魚類、蝦類、蟹類種質資源遺傳學研究中有著廣泛的應用前景。目前RAPD分析主要應用于標記鑒定、遺傳作圖、系統發育和進化及親緣關系的研究、種群的劃分、群體遺傳多樣性研究等。但在實際應用中,RAPD也表現出不足,如顯陽性位點,在后代中不能區別是純合體還是雜合體;穩定性較差;高度的變異性等缺點。當然有些是可以避免的,解決的方法是對單鏈引物進行篩選,優化反應條件,但第一個缺點是無法避免的。如能把RAPD與其它分子標記如RFLP、AFLP和微衛星等結合使用,RAPD仍將會發揮更好的用途。總之,隨著生物技術的不斷發展和更多應用,RAPD技術也將更加完善,應用更加廣泛。


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