miRNA 模擬物是化學合成的，雙鏈RNA分子（通常長度為18–24個核苷酸），通過轉染到細胞中，模擬成熟的內源性miRNA分子。miRNA抑制劑是單鏈（通常長度為21–25個核苷酸），經過修飾的RNA分子，通過轉染到細胞中，特異性的抑制miRNA的功能。模擬物和抑制劑包含一些化學修飾，以便提高活性或者增強其在體內的穩定性。
通過將miRNA模擬物轉染到細胞中，并進行下游的基因表達分析或者表型分析，可以闡明特定miRNA分子的目標和發揮的作用。這些實驗可以研究單個miRNA錯誤調節所造成的生物學影響，也能用于確定某個miRNA分子的特異性靶標基因。miRNA轉染之后，如果降低或者提高基因的表達水平，說明研究的miRNA參與調節了這個基因的表達。類似的，miRNA在很多通路中的作用，都可以通過檢測miRNA模擬物或者抑制劑轉染之后的特定表型來研究。
miRNA模擬物/抑制劑轉染對于下游應用的影響，通常可以通過如下方案來分析：
攜帶有報告基因，比如熒光素酶，和一個或者多個位于3’端非翻譯區的miRNA結合位點的質粒載體做為miRNA的靶標。miRNA的模擬物/抑制劑與載體共轉染到細胞中。在轉染之后，進行報告基因檢測實驗，比如熒光素酶檢測實驗。通過將上述轉染的結果與只轉染質粒載體的結果比較，確定miRNA模擬物和抑制劑的影響。
將miRNA的模擬物/抑制劑轉染到細胞中，然后檢測相關的內源性基因（即所研究的miRNA分子的靶標）的表達。通過將結果與未轉染的細胞或者轉染了陰性對照的細胞的表達結果相比，可以確定miRNA模擬物/抑制劑的作用。由于miRNA通常抑制目標基因的翻譯，而不降解目標基因的轉錄本，因此，一般通過檢測蛋白的表達水平來確定基因的表達水平，比如通過蛋白質印跡法。這意味著miRNA模擬物/抑制劑的影響通常不能通過定量的real-time PCR 來檢測。
| siRNA和RNAi |
siRNA 小干擾RNA（通常稱做siRNA）參與多種生物學過程——最常見的是RNA干擾或者RNAi。 大多數RNA是單鏈的，但是，siRNA由兩條互補的核酸鏈組成，與DNA類似。siRNA的長度大約為20–25個核苷酸。siRNA在RNAi過程中扮演了重要角色，它們通過互補的核苷酸序列來干擾特定基因的表達。 長度為21個核苷酸的雙鏈siRNA分子的一些近似值：
RNAi RNA干擾（或者RNAi）是細胞中的一種自然發生的過程，它能夠關閉或者沉默特定基因的活性。RNA干擾于1998年被發現，現在已經是研究基因功能的強大工具。 RNAi通過干擾信使RNA（mRNA）所攜帶的信息發揮作用，從而抑制蛋白的合成。mRNA失去活性，基因也就失活了。 誘導RNAi的雙鏈RNA分子（siRNA），在進入細胞之后，被Dicer酶切割成小的片段。這些小的片段，作為引導物，引導siRNA與具有互補序列的mRNA相結合。然后，這些細胞內的mRNA被切割，從而有效地破壞了它們所攜帶的信息，并且沉默相應基因的表達。 RNAi的過程相當復雜。雙鏈RNA被RNase III識別，然后切割成21–23個核苷酸大小的siRNA分子。這些siRNA分子參與組成了稱做RISC（RNA-induced silencing complex，RNA 誘導的沉默復合物）的RNAi靶標復合物，這些復合物能夠破壞與siRNA同源的mRNA分子。靶標mRNA分子在其與siRNA分子序列互補區域的中心處被切割，然后導致靶標mRNA分子被降解，降低了蛋白的表達。 使用siRNA siRNA分子是RNAi過程中的主要效應因子，可以通過化學方法或者酶催化的方法在體外合成。siRNA的序列設計對于有效的基因沉默是非常關鍵的，它們的設計方法是基于對RNAi過程的理解，以及對天然存在的siRNA分子的功能的理解，開發出來的。 siRNA的輸送對于基因沉默實驗是至關重要的。合成的siRNA分子可以通過電穿孔或者親脂的試劑，輸送到細胞內。但是，這兩種方法都是暫時的。質粒系統能夠用于表達短發卡RNA（shRNA）分子，它們是Dicer酶的底物，在體內能成熟成為siRNA分子。這樣的系統能穩定地抑制目標基因的表達。也有一些病毒輸送系統，能夠將shRNA輸送到難于轉染的細胞系中。 RNAi實驗原理及流程 |