RNA實驗和方案新手必讀（八）

來源

rRNA

大小(kb)

E. coli

16S 
23S

1.5 
2.9

S. cerevisiae

18S 
26S

2.0 
3.8

小鼠

18S 
28S

1.9 
4.7

人

18S 
28S

1.9 
5.0

變性凝膠分析的原理

利用RNA在甲醛瓊脂糖凝膠中的電荷遷移效應，可對RNA進行分離和鑒定。RNA不像DNA，它們具有復雜的二級結構，因此需使用變性凝膠。凝膠中的甲醛能夠破壞RNA的二級結構，從而使得RNA分子嚴格按照電荷遷移的方式得到有效分離。

在電場中，主鏈磷酸基團上所攜帶的負電荷使核酸分子向陽極移動。變性的RNA分子的遷移速率取決于它們的尺寸大小；不過片段大小與遷移速率之間并非線性相關，因為更大的片段會遇到更大的摩擦阻力，在凝膠中移動更為困難。

瓊脂糖凝膠分析是最為常用的RNA分析方法，通常依據RNA的大小相應選擇合適分辨范圍的瓊脂糖凝膠。小的RNA片段，如tRNA或5S rRNA，可以使用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析。可查閱分子生物學手冊（2,4）以獲得關于各類分析膠的詳細信息。本節將針對甲醛瓊脂糖凝膠電泳進行介紹。

制備用于RNA分析的甲醛瓊脂糖凝膠

下列甲醛瓊脂糖（FA）凝膠電泳方案能夠提高凝膠分離及后續檢測（例如RNA印跡）的靈敏度。本方案的關鍵特點在于使用了濃縮的RNA上樣緩沖液，從而（相比傳統實驗方案）能夠向凝膠中載入更大量的RNA樣本。

瓊脂糖

用于制備凝膠的瓊脂糖是針對所分離RNA片段的大小來確定濃度范圍的。對于大多數的目的RNA種類來說，使用1.0–1.2%（質量體積比）的瓊脂糖濃度可獲得最佳結果。對于較大的mRNA種類，降低瓊脂糖濃度可能會有所幫助。如需分離更小的mRNA，瓊脂糖濃度可提高至2%。對于較小的RNA種類，如tRNA或rRNA，則推薦使用聚丙烯酰胺凝膠電泳。

請使用超純瓊脂糖，因為如多糖類、鹽類和蛋白一類的雜質都會對RNA的遷移造成影響。

小貼士：某些電泳槽的塑料不耐乙醇。請對此適當留意，并核對廠商的說明書。
Total RNA-甲醛瓊脂糖凝膠

每個泳道10ug RNA