一、材料與設備
1. siRNA 表達載體（含 U6 或 H1 啟動子）。
2. 人工合成的 DNA 寡聚核苷酸。
3. 限制性內切核酸酶。
4. T4 DNA 連接酶。
5. DNA 凝膠回收試劑盒。
6. 2X 退火緩沖液（200 nmol/L KAc，4 mmol/L MgAc，60 mmol/L Hepes-KOH， pH 7.4 )。
7. U6 或 H1 啟動子片段。
8. Taq DNA 聚合酶。
9. PCR 產物回收試劑盒。
10. PCR 擴增儀。
二、操作方法
1. 載體表達法
(1) 根據所選定基因的靶序列，設計并合成兩條互補的 DNA 寡聚核苷酸，具體的設計要依據表達的分子是發夾式 siRNA 分子或正義與反義 RNA 單鏈的不同而不同。
同時在寡核苷酸的兩端均應包含適當的酶切位點，以便在互補的兩條鏈退火形成雙鏈后能在其兩側產生合適的酶切位點的未端，便于后續的克隆。
(2) 用適量的無菌雙蒸水溶解人工合成的 DNA 寡梭苷酸。
(3) 在 2X 退火緩沖液中加入適量的無菌水和人工合成的寡核苷酸模板，使兩條 DNA 鏈的終濃度均為 20 mmol/L，將上述混合液置于 90℃ 變性 1 min，然后再置于 37℃ 溫育 1 h。在反應液中加入 1/3 體積的 NH4Ac 和兩倍體積的無水乙醇，置 -20℃ 30 min，然后于 4℃ 12000 r/mm 離心 10 min以回收核酸。
(4) 取 siRNA 表達載體（含 U6 或 H1 啟動子）經合適的酶切，再經瓊脂糖凝膠電泳回收，然后與步驟 ( 3 ) 中回收的雙鏈核酸在 T4 DNA 連接酶的作用下連接，將獲得的陽性重組克隆進行測序以確定插入片段的正確性。在克隆的過程中應盡量保證表達 siRNA 分子的模板的第一位堿基與 U6 或 H1 啟動子的轉錄起始位點相同。
(5) 取適量的陽性重組質粒在核酸轉染試劑如 Lipofectaminc 2000 的介導下轉染實驗用細胞，然后可以在 48 h 后觀察靶基因的瞬時抑制效果，也可以依據表達栽體中含有的穩定篩選標志 ( 如 Neomycine 抗性基因），采用特定的抗生素（如 G418）進行篩選，獲得穩定的克隆細胞株后再觀察靶基因表達抑制后的長期效應。
2. PCR 方法
(1) 設計 U6 或 H1 啟動子啟動 PCR 擴增的 5' 端引物，并依據表達 siRNA 分子的不同（表達發夾式 siRNA 分子或分別表達組成 siRNA 分子的兩條單鏈）設計不同的 3' 端 PCR 擴增引物。當在細胞中表達發夾式 siRNA 分子時，其 3' 端引物包括與 U6 啟動子 3' 端互補的序列（20 nt）、靶位點的正義鏈序列、loop 環序列、靶位點的反義鏈序列、連續的 5 個 A ( U6 啟動子的轉錄終止信導，其后的序列將不被轉錄）以及附加的適當的酶切位點（便于后續的克隆）；如果需要在細胞中分別表達 siRNA 分子的正義與反義 RNA 單鏈時，釆用的 3' 端引物包含與 U6 啟動子 3' '端互補的序列和靶序列的正義或反義鏈（19 nt），在它們的 3' 端為連續的 5 個 A 和附加的適當的酶切位點。
(2) 在細胞中分別表達 siRNA 分子的正義與反義鏈時，使 5‘ 端引物分別與表達正義與反義單鏈的 3' 端引物配對進行 PCR 擴增，將獲得的正義與反義鏈分別純化后即可以在核酸轉染試劑如 Lipofecta -mine 2000 的介導下轉染靶細胞。在細胞中， RNA 聚合酶Ⅲ 可以分別以兩條 PCR 產物為模板轉錄合成 siRNA 分子的兩條單鏈，它們在細胞中再退火形成雙鏈的分子。
(3) 如果要在細胞中表達發夾式的 siRNA 分子，使 5' 端引物與對應的 3' 端引物配對進行 PCR 擴增。將獲得的 PCR 產物純化回收后即可以在核酸轉染試劑的介導下轉染靶細胞。雖然采用的 3' 端引物相對比較長，而且容易形成二級結構，在 PCR 擴增的時候容易引起麻煩，但這種方法相對比較簡單，操作步驟較少，而且可以避免多次 PCR 擴增過程中引入的序列突變。
(4) 對于那些通過瞬時轉染篩選獲得的對靶基因有較好抑制效果的 siRNA 分子，可以通過利用在 PCR 引物中引入的酶切位點將表達這些 siRNA 分子的 PCR 產物克隆到含有穩定篩選標志（如 Neomycine 抗性基因）的載體中，并通過相應的抗生素（如 G418 ) 篩選獲得穩定表達的細胞株，由此可以觀察抑制靶基因表達后細胞表型變化的長期效應。 | 