RNA干涉實驗

實驗方法原理 當確定了靶基因上的 siRNA 分子作用位點以后，根據靶位點的序列可以很方便地推導得到相應的 siRNA 分子的正義與反義 RNA 鏈序列。它們包含 19 bp 的互補雙鏈區和兩側的不配對區（每側為 2 個 U 成 2 個 T )，在合成時用 T 替代 U 可以降低成本并可以提高 siRNA 分子的穩定性，利用 DNA/RNA 合成儀首先分別合成長為 21 nt 的 siRNA 分子的正義鏈和反義鏈，然后在體外將它們退火形成雙鏈 siRNA 分子。

實驗材料 RNA 單鏈分子

試劑、試劑盒 退火緩沖液核酸轉染試劑DEPC處理水

儀器、耗材 NuSieve GTG 瓊脂糖凝膠

實驗步驟

一、材料與設備

1. 化學合成的正義與反義 RNA 單鏈分子。

2. 2X 退火緩沖液（200 nmol/L KAc，4 mmol/L MgAc2，60 mmoI/L Hepes-KOH pH 7.4)。

3. NuSieve GTG 瓊脂糖凝膠（) 。

4. 核酸轉染試劑（如 Lipofetamine 2000)。

5. DEPC 處理水。

二、操作方法

1. 用適量經 DEPC 處理的無菌水分別溶解化學合成的正義與反義 siRNA 分子 RNA 鏈。

2. 在 2X 退火緩沖液中分別加入適量的 DEPC 處理無菌水、正義與反義 RNA 鏈，使正義與反義 RNA 鏈的終濃度均為 20 mmol/L。

3. 將上述混合液置 90℃ 變性 1 min，然后置 37°C 溫育 1 h，經退火形成的 siRNA 分子可以直接用于轉染細胞，或置 -20℃ 保存備用。siRNA 雙鏈復合物可以經過幾輪凍融而不受影響，不需要經過再次變性退火處理。但是在處理 siRNA 分子時，建議最好將 RNA 溶液置冰浴中，以降低 RNA 水解的速率。

4. 可以采用 4% 的 NuSieve GTG 瓊脂糖凝膠電泳或者 10%~15% 的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢驗退火的效率。但應注意的是 NuSieve 瓊脂糖是一種低溶點瓊脂糖，因此在電泳時采用過高的電流時它會熔解。

5. 將 siRNA 雙鏈分子在核酸轉染試劑如 Lipofectaminc 2000 的介導下轉染靶細胞，并分析它對靶基因的抑制效果。