背景介紹
實驗前方法/試劑的選擇
問題解答 (外源性污染導致的問題不在本解答考慮中)
RNA 抽提的“三大紀律八項注意”
Rnase 污染的10大來源
RNase 和 DEPC 處理
RNA 抽提的10大竅門
提高 RNA 得率
經典抽提小技巧
特殊組織的抽提
樣品凍融的影響
RNA 質量的判斷
RNAguard：使降解成為歷史的試劑
背景介紹
對大部分實驗人員來說，RNA 抽提比基因組 DNA 抽提要困難得多。事實上，現有的 RNA 抽提方法/試劑，如果用于從培養細胞中抽提 RNA，比抽提基因組 DNA 更方便，成功率也更高。那為什么同樣的方法用于組織 RNA 的抽提，總會碰到問題呢？
組織 RNA 抽提失敗的兩大現象是： RNA 降解和組織內雜質的殘留。關于降解問題，首先看一下為什么從培養細胞中抽提 RNA 不容易降解。現有的
RNA 抽提試劑，都含有快速抑制 Rnase
的成分。在培養細胞中加入裂解液，簡單的混勻，即可使所有的細胞與裂解液充分混勻，細胞被徹底裂解。細胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住細胞內的
Rnase，所以 RNA 得以保持完整。也就是說，培養細胞由于很容易迅速與裂解液充分接觸，所以其 RNA 不容易被降解；反過來講，組織中的
RNA 之所以容易被降解，是因為組織中的細胞不容易迅速與裂解液充分接觸所致。因此，假定有一種辦法，在抑制 RNA
活性的同時能使組織變成單個細胞，降解問題也就可以徹底解決了。液氮碾磨就是最有效的這樣一種辦法。但是，液氮碾磨方法非常麻煩，如果碰到樣品數比較多的時候更加會有此感覺。這樣就產生了退而求其次的方法：勻漿器。勻漿器方法沒有考慮細胞與裂解液接觸前如何抑制
Rnase 活性這個問題，而是祈禱破碎組織的速度比細胞內的 Rnase 降解 RNA
的速度快。電動勻漿器效果較好，玻璃勻漿器效果較差，但總的來說，勻漿器方法是不能杜絕降解現象的。因此，如果抽提出現降解，原來用電動勻漿器的，改用液氮碾磨；原來用玻璃勻漿器的，改用電動勻漿器或者直接用液氮碾磨，問題幾乎
100%
能獲得解決。影響后續實驗的雜質殘留問題，其原因比降解更多樣，解決方法響應也不同。總之，如果出現降解現象或者組織內雜質殘留現象，則必須對具體實驗材料的抽提方法/試劑進行優化。優化大可不必使用您的寶貴樣品：可以從市場上購買一些魚/雞之類的小動物，取相應部分的材料用于
RNA 抽提，其它部分用于抽提蛋白質 – 用嘴碾磨，腸胃抽提。
究竟怎樣才能確保 RNA 抽提的成功率呢？實驗前選擇合適的方法/試劑，這是最重要的一步；好的方法/試劑在確保成功的同時，操作方便，經濟實用。當然，您的選擇可能仍然有問題，這就需要能正確分析實驗失敗的原因，以便改進。
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實驗前方法/試劑的選擇
0：抽提 RNA 的目的
RNA 用于不同的后續實驗，其質量要求不盡相同。cDNA 文庫構建要求 RNA 完整而無酶反應抑制物殘留；Northern 對 RNA
完整性要求較高，對酶反應抑制物殘留要求較低；PCR" onclick="tagshow(event)"
class="t_tag">RT-PCR 對 RNA 完整性要求不太高，但對酶反應抑制物殘留要求嚴格。投入決定產出；每次都以獲得最高純度的
RNA 為目的，勞民傷財。
1：樣品的收集/保存 – 影響降解的因素
樣品離開活體/或者原來的生長環境后，樣品中的內源酶即會開始降解
RNA，降解速度與內源酶含量及溫度有關。傳統上，只有兩個辦法可以徹底抑制內源酶活性：立即加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿；切成小塊后立即投入液氮冷凍。這兩個辦法都要求操作快速。后者適合所有的樣品，而前者只適合細胞及內源酶含量較低的并且較容易勻漿的組織。具體地講，植物組織，肝臟，胸腺，胰腺，脾臟，腦，脂肪，肌肉組織等最好都先用液氮冷凍起來，再往下做。
2：樣品的破碎及勻漿 – 影響降解和得率的因素
樣品的破碎是為了徹底勻漿，勻漿是為了使 RNA
徹底完整地釋放出來。細胞無須破碎即可直接勻漿，組織需要破碎后才能勻漿，酵母菌和細菌需要先用相應的酶破壁后才能勻漿。內源酶含量較低并且較容易勻漿的組織可以在裂解液中通過勻漿器一次完成破碎和勻漿過程；植物組織，肝臟，胸腺，胰腺，脾臟，腦，脂肪，肌肉組織等樣品，它們不是內源酶含量高，就是不容易勻漿，所以必須將組織的破碎和勻漿分開操作。最可靠而且得率最高的破碎方法是使用液氮的碾磨，最可靠的勻漿方法是使用電動勻漿器。使用液氮碾磨要特別注意一點：在整個碾磨過程中，樣品不得融化，因為冷凍后內源酶更容易起作用。