3：裂解液的選擇 – 影響操作方便程度，內源雜質殘留的因素
常用的裂解液幾乎都能抑制 Rnase 活性，因此，選擇裂解液的重點是要結合純化方法一起考慮。只有一個例外：高內源酶含量的樣品建議使用含苯酚的裂解液，以增加滅活內源酶的能力。
4：純化方法的選擇 – 影響內源雜質殘留。抽提速度的因素
對于干凈的樣品，如細胞，手邊的幾乎任何純化方法都可以獲得滿意的結果。但對于許多其它樣品，尤其是植物，肝臟，細菌等雜質含量很高的樣品，選擇合適的純化方法是至關重要的。柱離心式純化方法抽提速度快，能有效去除影響
RNA 后續酶反應的雜質，但價格較貴；使用經濟而經典的純化方法，如 LiCl 沉淀等，也可以獲得滿意的結果，但操作時間長。
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問題解答 (外源性污染導致的問題不在本解答考慮中。防止外源性污染的辦法見 ‘Rnase 污染的10大來源’)
RNA 的降解
理論上 28S:18S = 2.7:1，實踐中達到該比值幾乎沒有可能，并且沒有必要。降解的標志是：28S:18S < 1。下面是最常見的導致 RNA 降解的原因及正確的做法：
新鮮細胞：如果試劑沒有問題，外源性污染也可以排除的話，降解幾乎都來自裂解液的用量不足。如果將裂解液直接加入培養皿中裂解細胞的話，一定要使裂解液能蓋住細胞。
新鮮組織：某些富含內源酶的樣品 (如肝臟，胸腺等)，即使使用電動勻漿器勻漿也不能避免 RNA 的降解。更可靠的方法是：在液氮條件下將組織碾碎，并且勻漿時使用更多裂解液。這些樣品使用玻璃勻漿器勻漿更不可靠。
冷凍樣品：樣品取材后應立即置于液氮中速凍，然后可以移至 – 70C 冰箱保存。樣品要相對小一點。樣品決不能不經液氮速凍而直接保存于 –70C
冰箱中。冷凍樣品，即使是冷凍細胞，如果不在液氮條件下碾磨碎，而直接加入裂解液中勻漿，RNA
比新鮮樣品更容易降解。樣品在與裂解液充分接觸前決不能出現融化，所以碾磨用具必須預冷，在碾磨過程中要及時補充液氮。樣品碾碎后，在液氮剛剛揮發完時，將樣品迅速轉移到含裂解液的容器中，立即混勻勻漿。
A260 /A280 比值低
蛋白質污染：確保不要吸入中間層及有機項。減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底。加入氯仿后首先要使勁混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。解決辦法是用 PCI 重新抽提一次，再沉淀，溶解。
苯酚殘留：確保不要吸入中間層及有機項。加入氯仿后首先要使勁混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。解決辦法是再沉淀一次后，溶解。
設備限制：測定 A260 及 A280 數值時，要使 A260 讀數在 0.10 - 0.50 之間。此范圍線性最好。
用水稀釋樣品：測 OD 時，對照及樣品稀釋液請使用 10 mM Tris，pH 7.5。用水作為稀釋液將導致比值的降低。
A260 /A230 比值低
抽提試劑殘留：確保洗滌時要徹底懸浮 RNA，并且徹底去掉 75% 乙醇。解決辦法是再沉淀一次后，溶解。
組織內雜質殘留：一般為多糖類雜質。解決辦法是改用其它辦法，如 LiCl 沉淀。
設備限制：測定 A260 及 A280 數值時，要使 A260 讀數在 0.10 - 0.50 之間。此范圍線性最好。
奇怪的電泳帶型
非變性電泳：上樣量超過 3ug，電壓超過 6V/cm，電泳緩沖液時間太長，均可能導致 28S 和 18S 條帶分不開。使用 2ug
上樣量，電壓小于 6V/cm，使用新鮮的電泳緩沖液并且頻繁混勻兩極的緩沖液，是獲得好的電泳結果的前提。(以 DNA 標準為參照，28S 和
18S 分別位于 2.0kb 和 0.9kb 左右。)
變性電泳條帶變淡：EB 與單鏈的結合能力要差一些，故同樣的上樣量，變性電泳比非變性電泳要淡一些。另外的可能是甲醛的質量不高。
下游實驗效果不佳
RNA 降解：見上面。
抽提試劑的殘留：加入氯仿后首先要使勁混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。75% 乙醇洗滌時，一定要使核酸沉淀懸浮起來。更好的是使用兩次洗滌，并且在倒掉第二次洗滌液后，再將離心管放入離心機中，離心數秒后，用移液器將殘留的乙醇小心吸掉。
樣品中雜質的殘留：從富含多糖等雜質的樣品中抽提 RNA 時，多糖往往同核酸一起被沉淀下來。用水溶解核酸時，發現有一些粉末狀不溶物，往往就是多糖。高速離心后，將上清移入另外一個離心管中，再次沉淀核酸，可以減少這些雜質。更好的是使用有針對性的純化方法。
DNA 污染：在 RNA 抽提操作中，少量 DNA 的污染是正常的，且對大部分下游實驗沒有大的影響。降低樣品起始量或者增加溶液使用量，能將
DNA 的污染降低到電泳看不見的水平。能夠徹底去除污染 DNA 的方法只有用 RNase-Free 的 DNase I 消化抽提的
RNA。殘留的 DNA 是否影響后續實驗，可以用下面的實驗檢測：以抽提好的 RNA 做模板進行 PCR 擴增：如果不出現目的條帶，DNA
的殘留無須去除，否則要使用 Dnase I 消化，或者重新試劑引物。