RNA抽提注意事項和經驗指南3 分析測試百科網wiki版

發布時間：2020-09-07 16:09 原文鏈接： RNA抽提注意事項和經驗指南3

RNA 抽提的“三大紀律八項注意”
　
紀律一：杜絕外源酶的污染。
注意一：嚴格戴好口罩，手套。
注意二：實驗所涉及的離心管，Tip 頭，移液器桿，電泳槽，實驗臺面等要徹底處理。
注意三：實驗所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必須確保 RNase-Free。
紀律二：阻止內源酶的活性
注意四：選擇合適的勻漿方法。
注意五：選擇合適的裂解液。
注意六：控制好樣品的起始量。
紀律三：明確自己的抽提目的
注意七：任何裂解液系統在接近樣品最大起始量時，抽提成功率急劇下降。
注意八：RNA 抽提成功的唯一經濟的標準是后續實驗的一次成功，而不是得率。
Rnase 污染的10大來源

1：手指頭 – 手指頭是外源酶的第一來源，所以必需戴手套并且頻繁更換。另外，口罩也必需戴，因為呼吸也是一個重要的酶來源。戴手套口罩的另外的好處是保護實驗人員。
2：槍頭，離心管，移液器 – 單純的滅菌是不能滅活 Rnase 的，所以槍頭和離心管要用 DEPC 處理，即使是標明為 DEPC 處理過的。移液器最好是專用的，用前用 75% 的酒精棉球搽拭干凈，尤其是桿子；另外，一定不要使用褪頭器。
3：水/緩沖液 – 一定要確保無 Rnase 污染。
4：實驗臺面 – 最起碼要用 75% 的酒精棉球搽拭干凈。
5：內源 Rnase – 所有組織均含內源酶，故組織用液氮速凍是降低降解的最好辦法。液氮保存/碾磨方法的確不方便，但對有一些內源酶含量很高的組織，卻是唯一的辦法。
6：RNA 樣品 – RNA 抽提產物可能都會含痕量的 Rnase 污染。
7：質粒抽提 – 質粒抽提往往用到 Rnase 降解 RNA，殘留的 Rnase 要用 Proteinase K 消化，PCI 抽提。
8：RNA 保存 – 即使低溫保存，痕量的 Rnase 亦會導致 RNA 降解。長期保存 RNA 的最好辦法是鹽/醇懸液，因為醇在低溫時抑制所有的酶活性。
9：陽離子 (Ca, Mg) – 在含這些離子時，80C 加熱 5 分鐘會導致 RNA 被剪切，故如果 RNA 需要被加熱，保存液需要含螯合劑 (1mM Sodium Citrate, pH 6.4)。
10：后續實驗所用的酶 – 酶均有可能被 Rnase 污染。

RNase 和 DEPC 處理

1：高壓滅菌是可以滅活部分 Rnase A 的。實驗證明：37 C 與 RNA 反應，沒有滅菌的 PBS，活性點為 100 pg/ml；滅菌后，活性點為 100 ng/ml。當然，滅菌后 Rnase 仍然不能認為沒有殘留。
2：DEPC 在水中半衰期為 30 分鐘。0.1% 的 DEPC 滅菌 15 分鐘可以認為徹底破壞了 DEPC。破壞后可以聞到一點氣味。
3：在1M Tris, 1M HEPES, 1M MOPS 中分別加入 1ug/ml Rnase A 和 0.1% 及 1% DEPC 實驗。結果提示，0.1% DEPC 只對 MOPS 有效，而 1% DEPC 對三種試劑都有效。
4：0.01% DEPC，0.1% DEPC，1% DEPC 有效去除 Rnase A　的濃度分別為：100 ng/ml，500ng/ml，1 ug/ml。但要注意，DEPC 滅活后的副產品，對有些后續實驗是有影響的。
RNA 抽提的10大竅門

1：快速阻止 Rnase 活性 – 樣品收集后快速冷凍，裂解時快速操作滅活 Rnase。
2：選擇合適的抽提方法 – 高核酶含量的組織，脂肪組織最好用含苯酚的方法。
3：預判質量要求 – Northern，cDNA 文庫構建對完整性要求高，RT-PCR, RPA (Ribonuclease protection assay) 對完整性要求不是很高。RT-PCR 對純度 (酶抑制物殘留) 要求很高。
4：徹底勻漿是提高得率和降低降解的關鍵。
5：檢查 RNA 的完整性 – 電泳檢測，28S:18S =2:1 是完整的標志，1:1 對大部分實驗也是可以接受的。
6：去除 DNA – 用于 RT-PCR, array analysis 最好用 Dnase I 去除 DNA。
7：降低外源酶的污染 – 不能從外面又導入酶。
8：低濃度的核酸濃縮時，要加入助沉淀試劑。但要防止助沉淀劑含酶及 DNA 污染。
9：徹底溶解 RNA，必要時可以 65C 加熱 5 分鐘。
10：合適的保存方法 – 短時間可以 –20C 保存，長期請保存于 –80C。
提高 RNA 得率

首先要意識到不同得樣品其 RNA 含量差別很大。高豐度 (2-4ug/mg) 的如肝臟，胰腺，心臟，中豐度 (0.05-2ug/mg) 的如腦，胚胎，腎臟，肺，胸腺，卵巢，低豐度 (<0.05ug/mg) 的如膀胱，骨，脂肪。
1：裂解細胞使 RNA 釋放出來 – RNA 如果不被釋放出來，得率是會降低的。電動勻漿比其它勻漿方法效果更好，但也可能需要結合其它得方法，如液氮搗碎，酶消化 (Lysozyme/Lyticase)
2：抽提方法的優化。基于苯酚的方法的最大問題是分層不徹底和部分 RNA 的丟失(不能全部將上清取出)。分層不徹底是因為核酸和蛋白質含量高，可以用增加裂解液使用量或者降低樣品量解決。脂肪組織要增加一步氯仿抽提。RNA 的丟失可以用反抽方法或者去除有機層后再離心的方法降低。基于柱離心式方法的最大問題是樣品過量。

更多與 RNA抽提注意事項和經驗指南3 相關的新聞