RNAi表達載體構建（一）

近年來的研究表明,一些短片斷的雙鏈RNA可以通過促使特定基因的mRNA降解來高效、特異的阻斷體內特定基因表達,誘使細胞表現出特定基因缺失的表型, 稱為RNA干擾（RNA interference,RNAi）.siRNA（small interfering RNAs）就是這種短片斷雙鏈RNA分子,能夠以序列同源互補的mRNA為靶目標,降解特定的mRNA.RNAi的發現具有劃時代的意義,它不僅深入揭示 了細胞內基因沉默的機制,而且它還是后基因組時代基因功能分析的有力工具,極大地促進了人類揭示生命奧秘的進程.現在越來越多的研究人員開始采用RNAi 來研究生物體的基因表達.RNAi技術可廣泛應用到包括功能基因組學,藥物靶點篩選,細胞信號傳導通路分析,疾病治療等等.

目前為止較為常用的5種制備siRNAs的方法包括：

·化學合成

·體外轉錄

·長片斷dsRNAs經RNase III 類降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)

·siRNA表達載體或者病毒載體在細胞中表達siRNAs

·PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達

獲得高純度的siRNA產物是進行實驗的第一步,而轉染的效率則是非常關鍵的因素.

一、基本概念

RNAi：（RNA interference）RNA干擾

內源性或外源性雙鏈RNA(dsRNA)介導的能誘導細胞內與其序列同源的特異基因表達沉默或抑制的效應,誘使細胞表現出特定基因缺失的表型,稱為RNA干擾,它也是體內抵御外在感染的一種重要保護機制.

siRNA ：(small interfering RNAs)小干擾RNA

由長dsRNA裂解而成的一種19-25nt的短片斷雙鏈RNA分子,能夠以同源互補序列的RNA為靶目標降解特定的mRNA, RNAi的關鍵效應分子.

shRNAs:(small hairpin RNA )小發夾RNA

是設計為能夠形成發夾結構的非編碼小RNA分子,shRNA需通過載體導入細胞后,然后利用細胞內的酶切機制得到siRNA而最終發揮RNA干擾作用.

Dicer：屬于RNaseⅢ 家族,是dsRNA的特異性核酸內切酶

RISC：(RNA-inducing silencing complex) RNA誘導的沉默復合體,具有核酸內切、外切以及解旋酶活性

二、機制

目前普遍認為,共抑制、基因壓制和RNAi很可能具有相同的分子機制,都是通過dsRNA的介導而特異地降解靶mRNA, 抑制相應基因的表達. 即RNAi、共抑制、quelling均屬于PTGS！現已初步闡明dsRNA介導的同源性靶mRNA降解過程主要分為兩步.

第一步（起始階段）是較長ds RNA在ATP參與下被RNaseⅢ樣的特異核酸酶切割加工成21~23nt的由正義和反義鏈組成的小干擾RNA（small interfering RNA,siRNA）.

第二步（效應階段）是siRNA 在ATP參與下被RNA解旋酶解旋成單鏈,并由其中反義鏈指導形成RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex,RISC).

RNAi途徑主要存在于細胞漿中,但是siRNA產生、靶mRNA降解的亞細胞位置尚未明確.外源性（注射或喂養）的dsRNA和病毒性dsRNA可能可以直接進入細胞漿中的RNAi途徑,僅在細胞漿中復制的RNA病毒可被dsRNA介導的沉默機制所抑制.外源性dsRNA則還可導致細胞核中的同源早期 RNA轉錄產物減少.

在許多機體中反向重復轉基因序列在細胞核內轉錄成發夾dsRNA,進而可介導RNAi,這種dsRNA可能需要轉移至胞漿中才可有效地沉默同源靶mRNA.

RNAi的放大效應機制

siRNA不僅可引導RISC切割靶RNA,而且可作為引物在RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA為模板合成新的dsRNA.

新合成的長鏈dsRNA同樣可被RNaseⅢ樣核酸酶切割、降解而生成大量的次級siRNA.次級siRNA又可進入合成-切割的循環過程,進一步放大RNAi作用.這種合成-切割的循環過程稱為隨機降解性PCR（random degradative PCR）.

三、RNAi表達載體的構建

1. 目的基因的確定

（1）、檢索文獻獲取有實驗證明有效的靶點序列（核對）

（2）、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

（3）、http://www.google.cn/ or http://scholar.google.com

2、設計siRNA靶序列

在制備siRNA 前都需要單獨設計siRNA序列.研究發現對哺乳動物細胞,最有效的siRNAs是21-23個堿基大小、3’端有兩個突出堿基的雙鏈RNA；而對非哺乳動物,比較有效的是長片段dsRNA.siRNA的序列專一性要求非常嚴謹,與靶mRNA之間一個堿基錯配都會顯著削弱基因沉默的效果.

（1）、選擇siRNA靶位點：

從轉錄AUG起始密碼子開始,搜尋下游AA序列,記錄跟每個AA 3’端相鄰的19個核苷酸作為候選的siRNA靶位點.有研究結果顯示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效. Tuschl等建議在設計siRNA時不要針對5'和3'端的非編碼區（untranslated regions,UTRs),原因是這些地方有豐富的調控蛋白結合區域,而這些UTR結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNP核酸內切酶復合物結 合mRNA從而影響siRNA的效果.