RTPCR實驗方法

RT-PCR定義：
是指對組織或細胞的總RNA進行抽提，把RNA反轉錄為cDNA，然后設計目的基因引物進行PCR，瓊脂糖電泳并數碼拍照，分析電泳條帶灰度值，判斷目的基因mRNA轉錄水平的相對量的變化。

RT-PCR流程簡介

一、抽提RNA：
1、防止RNA酶污染
180℃的高溫下干烤6hr以上；
0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗；
去污劑洗滌，雙蒸水沖洗；
溶液皆用0.1% DEPC水配置，試劑應為新開封或RNA專用；
操作人員戴手套；
器械專用。
2、材料的準備
組織及細胞最好為新鮮的，或者在－70℃條件下保存半年以下；
盡量避免材料的凍融 。

3、確認RNA的質量
檢測RNA溶液的吸光度：
OD260/OD280=1.8－2.0
RNA的電泳圖譜：
28S和18S條帶明亮、清晰、指條帶邊緣清晰，并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上。

二、反轉錄：
單管一步法
反轉錄和PCR反應在一個管子中完成 ，得到的全部cDNA產物都一起經PCR擴增 ，靈敏度更高，但是容易相互干擾 。
兩步法
反轉錄和P CR分開做，PCR取反轉錄反應產物的1/10進行，更為靈活而且嚴謹，但是靈敏度不如前者高。

三、PCR：
1、參照基因 PCR
參照基因一般選擇看家基因（長表達、高表達量 的基因），常用18S、β－actin、bubulin、GAPDH，其中ACTIN最為普遍；
參照基因與目的基因在同一個管子內進行PCR反應的情況下，稱之為內參；
參照基因與目的基因在不同管子內反應成為外參；
由于內參可能與目的基因競爭模板及酶，或造成其它干擾，外參的應用較為普遍。

2、目的基因 PCR
典型的引物18到24個核苷長，引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。

RT-PCR實例：
1、實驗材料：擬南芥野生型Ws及突變體m1、m2花序
2、實驗目的：分析m1、m2與野生型花序中G1基因的表達的差異
3、實驗步驟：
設計ACTIN及G1基因的引物；
分別抽取野生型Ws及突變體m1、m2花序RNA，DNase I處理，以盡量去除基因組DNA；
電泳檢測，估計RNA總量；
取1ug左右的RNA進行反轉錄；

取反轉錄好的cDNA總量的1/10（10ul反轉錄體積則取1ul），稀釋10倍（稀釋至10ul），取1/10（1ul）為模板，用ACTIN引物、普通PCR體系、20－25個循環、以基因組DNA為對照（因為引物跨內含子，所以基因組DNA擴增出的條帶大小與cDNA擴增出的條帶大小不同，以去除殘留的基因組DNA的影響）做PCR；
取等量產物電泳，根據電泳條帶的亮度調整模板量（如m1的亮度為Ws的2倍，則下次PCR時m1的模板為0.5ul），直到電泳亮度基本一致，可認為此時所取的不同體積的野生型Ws及突變體m1、m2模板里RNA的含量基本相同。
以G1基因引物，按調好的模板體積做PCR，電泳。
根據電泳條帶的亮度比較野生型Ws及突變體m1、m2中G1基因的表達差異。