做RNA病毒基因的RT-PCR成敗的關鍵首先在于RNA模板的制備。本人三年前做過一個正鏈RNA病毒全基因組分段擴增，設計方案是將全基因組分成7個片段，0.6kb-3.3kb不等，分別進行RT-PCR擴增，剛開始的三個月，我們課題組三個人辛辛苦苦，什么招都想過了，結果連一個片段都沒有拿到。后來有一個周末，我一個人安安靜靜做了一天，PCR跑膠的結果足以讓我興奮一個月：一下子隱隱約約出了3個片段！！！緊接著把膠里的弱帶切下，水溶并后做二次擴增(注：跑膠總會吧，在UV下，參照marker，將特異性高，且與預期大小相同的DNA帶切出，放在一個ep管里，加入適量無菌水，用槍頭將膠反復攪碎，高速離心，小心吸取2ul上清用作模板，進行第二次PCR擴增)很快，三個預期的片段都得到了理想的擴增。不到一個月，12kb的全基因組各片段全部收歸囊下。
我這次成功的關鍵在于：提取RNA時，收集沉淀這一步。離心速度不要低于13000rpm（r=5cm），提高離心速度、延長離心時間，在離心前的沉淀也盡可能在低溫下長時間進行，這些時我本人總結出來的經驗。在后來的實驗中，幾乎每次RT-PCR都非常順利，除了材料本身就沒有目標基因。
這一次談一下逆轉錄酶和逆轉錄反應的問題，在一般的逆轉錄反應中，較常用的是MMLV（鼠源的）和AMV（禽源的）兩種，現在更有各家公司推出的耐熱的（50-60度）、超長片段的逆轉錄酶，這方面具有專長的數gibco（現在并購于invitrogen）。
我們實驗室使用的一般是MMLV，鼠源的酶，雖然活性比較低一點，但是對應的RNaseH活性也很低，在長時間的逆轉錄過程中，不會造成模板的降解，獲得cDNA的幾率大，適用于較長的cDNA鏈的合成。對于從細胞培養物中利用RT-PCR方法擴增mRNA豐度低的基因也很有效。但是AMV也有其自身的優點，酶的活性很高，擴增1kb以下的基因時比較常用，我知道臨床上血液檢測中有時使用AMV，省時，也省試劑。
另外，MMLV逆轉錄反應的條件比較好掌握，反應液的組分簡單，AMV的反應液有的需要添加焦磷酸鈉（這種試劑不好找到）。
反應溫度最好每次都控制不變，MMLV我每次都使用37度，雖然mannual上說使用特異性引物可以升到42度進行逆轉錄反應，但是有一次42度沒有擴增結果，改為37度卻擴出了所需要的帶（使用的20mer特異性引物），從此以后我一直使用37度，后來的結果也還可以。
長片段逆轉錄，比如某些RNA病毒的全基因組RT-PCR擴增，10kb左右，可以選用上面提到的耐熱、RNaseH-的逆轉錄酶，可能比較貴一點，但是很多文獻報到能夠得到很好的擴增，本人嘗試過，說實話，可能沒有太認真去優化條件，很遺憾連設計的6kb都沒有得到擴增產物。由此，我建議大家不要輕易嘗試這個方法，一則擴增的難度確實存在，另外，擴增的忠實性不能得到很好的保證。不同的實驗目的也不一樣，一下子得到這樣長的片段，后續的改造也很困難。
還有一個需要指出的問題是，有些同行喜歡一下子提很多RNA，加保護劑如RNase inhibiter等，凍存，以后長期使用，我不推薦這樣做。RNA在低量存在時非常容易降解，任何保存方法都比不上不保存^_^，我的做法是馬上做RT，不吃飯也要做上去，為了省去日后不盡的麻煩，切記切記！