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  • 發布時間:2019-08-02 23:14 原文鏈接: TRIzol法同時提取RNA、DNA、蛋白質

    TRIzol試劑適用于從細胞和組織中快速分離RNA。TRIzol試劑有多組分分離作用,與其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、鹽酸胍法、硫氰酸胍法等相比,最大特點是可同時分離一個樣品的RNA\DNA\蛋白質.TRIzol使樣品勻漿化,細胞裂解,溶解細胞內含物,同時因含有RNase抑制劑可保持RNA的完整性。在加入氯仿離心后,溶液分為水相和有機相,RNA在水相中。取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA;用乙醇沉淀中間層可回收DNA;用異丙醇沉淀有機相可回收蛋白質。

    TRIzol試劑可用于小量樣品(50~100mg組織、5×106細胞)也適用于大量樣品(≥1g組織、>107細胞)。對人,動物,植物組織,細菌均適用,可同時處理大量不同樣品,整個提取過程在一小時內即可完成。分離的總RNA無蛋白質和DNA污染,可用于Northern Blot,dot blot,ployA篩選,體外翻譯,RNase保護分析和分子克隆。在用于RT-PCR時如果兩條引物存在于一個單一外顯子內,建議用無RNase的DNaseⅠ處理RNA樣品,避免出現假陽性。共純化的DNA可用作標準,比較不同樣品RNA的得率,也可用于PCR和酶切。蛋白質可用于Western Blotting。

    規格:100ml 黃色透明液體

    儲存條件:2~8℃避光保存12個月

    注意:請勿直接接觸皮膚或吞咽,以免灼傷。如接觸皮膚應立即用洗滌劑和大量水沖洗。忌用乙醇擦洗,乙醇會加重灼傷程度。

    預防RNase污染注意事項:

    1.經常更換新手套,皮膚上常帶有的細菌,霉菌可能成為RNase的來源。

    2.使用滅過菌的RNA專用塑料制品避免交叉污染。

    3.RNA在TRIzol試劑中時不會被RNase污染,但提取后繼續處理過程中應使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小時,塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分鐘,然后用水徹底清洗,高壓滅菌,即可去除RNase。

    4.配制溶液應使用無RNase的水(將水加入處理過不含RNase的玻璃瓶中,加入DEPC至終濃度0.01℅v/v,放置過夜,高壓滅菌

    注:DEPC有致癌之嫌,需小心操作)。

    RNA的提取

    準備試劑:氯仿,異丙醇,75℅乙醇,無RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC處理過的水配制)。

    操作步驟:

    1. 勻漿處理:

    a.組織將組織在液氮中磨碎,每50~100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

    b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞,每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml,用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定,不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

    c.細胞懸液離心收集細胞,每5~10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1mlTRIzol,反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。

    2.將勻漿樣品在室溫(15~30℃)放置5分鐘,使核酸蛋白復合物完全分離。

    3.可選步驟:如樣品中含有較多蛋白質,脂肪,多糖或胞外物質(肌肉,植物結節部分等)可于2~8℃10000×g離心10分鐘,取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。處理脂肪組織時,上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

    4. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿,劇烈振蕩15秒,室溫放置3分鐘。


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