1. 取下組織，立即用新制備的 4% 甲醛固定，室溫過夜。用多聚甲醛制備 4% 的甲醛溶液，在 100 ml 水中加 8 g 多聚甲醛，在通風櫥中加熱至 50~60℃，加幾滴 1 mol/L NaOH 使固體全部溶解。多聚甲醛全部溶解后，將溶液放冰上，迅速冷卻至室溫。加 100 ml pH 7.2 的 2X PBS，過濾固定液。甲醛儲存液應在每次實驗前新配。
2. 通過 50%、70%、80%、95%、100% 乙醇和 100% 二甲苯系列孵育使組織脫水。
3. 用石蠟包埋組織，制備 5 μm 厚的切片，固定于玻片上。將石蠟切片 70℃ 加熱 10 分鐘或 58~60℃ 加熱 30 分鐘去除石蠟。
4. 通過以下溶液進行系列轉移水合切片：二甲苯 5 分鐘 2 次，96% 乙醇 3 分鐘 2 次，然后 90%、80%、70%、50%，雙蒸水各 3 分鐘。
5. 在冷的 4% 甲醛中后續固定切片 5 分鐘，用 pH 7.2 的 PBS 清洗 3 次，每次 5 分鐘。
6. 室溫下用 1~2 μg/ml 蛋白酶 K 的 10 mmol/L Tris-HCl 溶液（pH 8.0）處理玻片 10 分鐘，用 PBS 清洗 3 次。
7. 用 0.5% H2O2 的 PBS 溶液室溫處理 20 分鐘，封閉內源過氧化物酶活性。
8. 用補充有 150 mmol/L NaCl 和 0.05% BSA 的 TdT 反應緩沖液預孵育切片。每個切片上加 27 μl 溶液，用已裁成合適大小的 Parafilm 膜覆蓋。
9. 室溫孵育 10 分鐘后，取下 Parafilm 膜，用紙巾吸去水。
10. 在用 TdT 反應緩沖液制備的 200 U/ml TdT 酶、2~4 μmol/L 地高辛配基偶聯的 dUTP 中孵育切片，再用 Parafilm 膜覆蓋切片，37℃ 溫室中 30 分鐘~1 小時。用 pH 7.2 的 PBS 將切片洗 3 次。
11. 用 5 U/ml 辣根過氧化物酶偶聯的抗地高辛孵育玻片，用 Parafilm 膜覆蓋。37℃ 溫室中孵育 30 分鐘。
12. 應用快速 DAB 底物，用 DAB 和 H2O2 處理檢測標記細胞，用過量水清洗切片。可用甲基綠復染切片 30 秒。用過量水清洗。
13. 通過用二甲苯終洗 2 次的系列乙醇使切片脫水。 展開 | 