快速、可靠的分析貝類中親脂性海洋生物毒素】
本文采用UPLC/MS/MS法對海洋中生物毒素進行快速、可開的定量分析。這是一種能夠快速、可靠地分析貝類中管制和非管制親脂性海洋生物毒素的方法。與傳統的HPLC/MS/MS方法相比，其分析速度提高了4倍(單次分析由20 min縮短為5 min)，可用于代替傳統的小鼠生物檢測法。
食用受到生物毒素污染的貝類(貽貝、牡蠣、蛤等)可能會引起人體嚴重中毒，如腹瀉性貝毒(DSP)。通常將DSP毒素歸類為親脂性海洋生物毒素，由多種浮游植物自然產生，因此也稱之為藻毒素。親脂性海洋生物毒素含有羧酸、磺酸、氨基和亞氨基等官能團，所以有一定的復雜性。
歐盟(EU)立法對不同類別的毒素進行管制，并在官方控制程序中具體介紹了對這些毒素實施監控的方式。如圖1所示。
在2011年7月之前，上述毒素的官方檢測方法是生物檢測法，該方法基于大鼠口服貝類肉或小鼠腹腔注射貝類提取物進行檢測。這種方法主要存在兩個問題：第一，有違生物倫理學;第二，不能科學地、可靠地測定痕量的特定毒素。
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圖1.a)管制毒素和b)非管制環亞胺類毒素的化學結構式。
采用生物檢測法進行檢測時，環亞胺類毒素的存在通常會使動物致死。環亞胺類毒素如圖1(B)所示，被歸類為親脂性海洋毒素。雖然這些毒素目前尚未受到管制，但歐洲食品安全局(EFSA)指出，這類毒素的毒性數據以及在貝類中的存在數據應當被更多地收集。
自2011年7月起，LC/MS/MS成為貝類中親脂性海洋生物毒素的官方檢測方法。歐盟引用的LC/MS/MS方法是使用固定的提取步驟提取生物毒素，再通過傳統LC方法在酸性或堿性流動相下進行分離，并使用串聯四極桿質譜進行檢測。
本次研究的目的是建立一種在堿性條件下比傳統LC方法更快速的常規分析方法，其中也包括EFSA關注的其他非管制類化合物的分析。在本應用紀要中，我們使用Waters? ACQUITY UPLC系統串聯Xevo TQ-S質譜儀，對包括部分非管制環亞胺類毒素在內的多種親脂性海洋生物毒素進行了5min的檢測分析。UPLC?技術能夠縮短分析運行時間，并且不會對色譜峰分離度和峰質量產生不良影響;Xevo TQ-S(串聯四極桿質譜儀)可提供超高靈敏度的檢測，還能夠在切換電噴霧正離子(ESI+)和負離子(ESI-)模式下同時采集多重反應監測(MRM)躍遷數據，該采集過程是分析親脂性海洋生物毒素的必需步驟。
表1. 親脂性海洋生物毒素的歐盟限制濃度和建議報出濃度。*為食用貝類
親脂性海洋生物毒素
歐盟限制濃度
（MMS）
（μg/kg）
0
0.125
0.25
0.5
1
1.5
OA 、DTX1 、DTX2 、PTX2
160 μg OA 當量/kg*
0
20
40
80
160
240
AZA1 、2、3
160 μg AZA1 當量/kg*
0
20
40
80
160
240
蝦夷扇貝毒素
1000 μg YTX 當量/kg*
0
125
250
500
1000
1500
GYM 、PnTX-E 、PnTX-F
200 μg/kg*
0
25
50
100
200
300
SPX1
100 μg/kg*
0
12.5
25
50
100
150
PnTX-G
50 μg/kg*
0
6.25
12.5
25
50
75
OA 、DTX1 、DTX2 、PTX2
160 μg OA 當量/kg*
0
20
40
80
160
240
AZA1 、2、3
160 μg AZA1 當量/kg*
0
20
40
80
160
240
蝦夷扇貝毒素
1000 μg YTX 當量/kg*
0
125
250
500
1000
1500
GYM 、PnTX-E 、PnTX-F
200 μg/kg*
0
25
50
100
200
300
SPX1
100 μg/kg*
0
12.5
25
50
100
150
PnTX-G
50 μg/kg*
0
6.25
12.5
25
50
75
實驗部分
UPLC條件
系統：ACQUITY UPLC，運行時間：5.0 min，色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 2.1×100 mm，1.7μm，柱溫：40 ℃，樣品溫度：10 ℃，流動相A：6.7 mM氫氧化銨水溶液，流動相B：乙腈/水(9:1)含6.7 mM氫氧化銨，弱清洗液：水/乙腈(9:1)，強清洗液：乙腈/水(9:1)，
流速：0.6 ml/min，進樣體積：5 μl。
時間（min）
流速（ml/min)
%A
%B
曲線
初值
0.6
70
30
N/A
0.5
0.6
70
30
6
3.5
0.6
10
90
6
4.0
0.6
10
90
6
4.1
0.6
70
30
6
5.0
0.6
70
30
6
MS條件
質譜儀：Xevo TQ-S，電離模式：ESI -/+，毛細管電壓：3.0 kV，源溫度：150 ℃，
脫溶劑氣溫度：500 ℃，脫溶劑氣流量：800 l/h，MRM方法：見表2。
標準品制備
經認證的標準品OA、DTX1,2、PTX2、YTX、AZA1,2,3、環亞胺毒素(GYM)和13-去甲基Spirolide C (SPX1);江瑤毒素E(PnTX-E)、F(PnTX-F)和G(PnTX-G)的半純化標準品;各種毒素的標準儲液均采用甲醇制備;使用空白貽貝提取物并加入儲液，繪制基質加標 (MMS)校準曲線;空白提取物按照樣品提取方法進行制備。基質加標標準品的濃度分別為驗證濃度的0、0.125、0.25、0.5、1.0和1.5倍(受管制毒素的驗證濃度水平與允許濃度接近，如表1所示)。
樣品提取
準備三份肉貝類全組織勻漿(1 g)，分別用3 ml甲醇進行提取。分別加入甲醇后渦旋混合。完成渦旋混合后，將提取物離心5 min，并轉移上清液至10 ml容量瓶中。待第三次提取完成后(共9 ml)，加入適量甲醇至體積為10 ml。所得貝類提取原液先用0.2 μm膜過濾器過濾，然后再加標進行分析。為測定DTX3(OA、DTX1和2的酯類形式)的含量，還用2.5 M氫氧化鈉對提取物進行了堿水解。再將堿性混合物在76 ℃下加熱40 min，并冷卻至室溫，最后用2.5 M鹽酸中和。
表2.各種親脂性海洋生物毒素的MRM躍遷。
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單日驗證
在單個實驗室中進行單日驗證研究，以便對UPLC/MS/MS方法進行評估。評估參數：線性、回收率、重復性、重現性、選擇性和判斷標準(CCα)。使用來自荷蘭國家監測計劃的空白貝類進行驗證，包括貽貝、牡蠣、鳥蛤和劍蟶。為了確保驗證所用的貝類為空白樣品，在研究開始之前對這些貝類進行了分析以確定是否存在表2中所示的毒素。將七份不同的貝類樣品(四份貽貝、一份牡蠣、一份鳥蛤和一份劍蟶)進行提取并加標，濃度分別為驗證濃度的0.0、0.5、1.0和1.5倍。
結果與討論
用甲醇稀釋各個環亞胺類毒素的儲液，用以通過IntelliStart?技術獲取調諧參數。IntelliStart?能夠自動進行儀器設置、化合物調諧和系統適用性檢查，極大地簡化了LC/MS系統的使用流程。各種毒素的m/z、錐孔電壓和碰撞能量見表2。對于貴重的毒素標準品，可以用提取物加標代替原貝類組織勻漿，能節約10倍量的標準品。提取物加標這一方法因對所有相關毒素都具有很高的提取率(>90%)已經得到了驗證。因此，導致假陰性結果的可 能性非常低。UPLC/MS/MS方法的開發基于之前由Gerssen等人所介紹的色譜法3。UPLC分離中除了原多甲藻酸受堿性條件的影響導致峰形較差外，對其它各類不同毒素都顯示出較好的分離效果。Xevo TQ-S使得即使在法規要求的靈敏度水平下也能輕松檢出色譜峰，各種毒素經5minUPLC分離得到的MRM色譜圖如圖2所示。
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圖2.貽貝基質中1.0倍驗證濃度的基質匹配標準品的MRM色譜圖。
對于每種化合物，存在兩個優化的MRM：一個用于確證,另一個用于定量。兩個MRM結果之間的離子比率可作為分析標準之一，用于確定生物毒素是否確認為陽性。另一個監管標準是化合物最大殘留量(MRL)。使用TargetLynx處理軟件能夠自動標記規定范圍內的參數，當這些參數超過限制濃度時，分析人員能夠非常容易地觀察到。
各種毒素的檢測靈敏度良好，甚至在濃度為驗證濃度(管制毒素的規定濃度)的0.125倍時，仍可獲得>3的信噪比。目前，部分受管制毒素的標準品仍無法獲得( PTX1、45OH YTX、homoYTX和45OH homoYTX)。為測定這些毒素，根據現有毒素標準品(PTX2和YTX)的結構而研究得到的方法中，其它的非管制親脂性毒素的MRM通道也包含在內，可利用該確證方法對其進行篩選，如圖2所示。這些實驗中確定的方法參數現已整合到Quanpedia數據庫中，此系統的所有用戶均可獲取該方法操作規程。
單日驗證結論
在單日驗證中，對不同方法的性能參數進行了評估，如線性、回收率、重復性、重現性、選擇性和CCα，如表3所示。
表3.單日驗證試驗結果。1包含ensis基質，2不含ensis基質，*重現性較差。
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對于所有毒素，基質加標的校準曲線在濃度范圍(0.125~1.5×PL)內表現出良好線性(R2>0.990)。除PnTx-E回收率達到 122%外，其它各種毒素的回收率均介于91%~104%的范圍內。如果采用甲醇制備提取物，先洗脫的化合物(保留時間為1.2 min)易產生甲酯，這也說明回收率較預期高但重復性較差(RSDr 23.1%)的原因。據觀察，所有受管制毒素的重復性良好。而在非管制毒素中，只有PnTx-E和SPX1略高于預期值。對于SPX1，出現上述情況是由蟶類基質引起的，如果去除蟶類的結果并重新計算，則重復性結果符合要求，在含蟶類基質和不含蟶類基質的情況下，重復性分別為14.6%和12.8%。若要確定一份樣品是否不符合規定，那么毒素濃度應≥判斷限(CCα)。判斷限是指在該濃度下能夠以1-α或95%(α=5%)的概率推斷樣品超出允許的濃度，以此判定該樣品是否符合規定。
