用于MDCK和 Vero細胞的生物反應器 WAVE Bioreactor 系統由一個帶有一次性塑料細胞培養袋的搖動平臺組成，配備CO2 氣體混合器 (CO2MIX20) 或WAVEPOD?控制塔用于控制pH、溫度、氧氣和混合。MDCK細胞在Cellbag-10 L和Cellbag-50 L的WAVE Bioreactor System 20/50中培養。Vero細胞在Cellbag-2 L和Cellbag-10 L的WAVE Bioreactor System 20/50中培養 。WAVEPOD 控制塔用于pH、溫度、氧氣和混合等參數的監測和反饋控制。
染色溶液 使用溶解于0.1 M檸檬酸中的0.1%結晶紫細胞裂解緩沖液進行 MDCK和 Vero 細胞的細胞核計數。臺盼藍（0.1%溶解在PBS中）用于測定細胞活率。 對于Vero細胞， 用于細胞固定和微載體培養物顯微鏡觀察的 Hematoxylin 蘇木紫染料溶液 (Carl Roth GmbH)由 0.9 g蘇木紫、0.18 g NaIO3、15.45 g Al K(SO4)2 ×12 H20、45 g 水合Chloralhydrate (Carl Roth GmbH) 和1 g 一水檸檬酸溶解于1 L的蒸餾水中配制而成。
細胞培養-MDCK細胞 MDCK細胞按照1:5到1:6每周傳代兩次。對于常規細胞培養和微載體接種，MDCK細胞先用 PBS-EDTA 洗滌，然后通過與Accutase酶在37℃孵育30 min使細胞從微載體上脫落。我們取出一部分脫落的MDCK 細胞樣品并用 CEDEX (Innovatis)測定細胞活率，此結果被用于計算達到目標接種密度所需的細胞數量。使用轉移瓶將懸浮細胞加入到Cellbag中。
細胞培養-Vero細胞 Vero 細胞按照 1:3 到 1:4 每周傳代兩次。在這種條件下，經過胰蛋白酶消化的微載體接種難度較大，因為胰酶容易削弱細胞貼附從而影響細胞在微載體上的鋪展。因此， 細胞用含有0.02 % EDTA的無Ca 2+ 和Mg 2+的PBS 從細胞工廠表面消化。10 層細胞工廠用 PBS 洗滌，細胞用100 ml EDTA 溶液消化后在37℃孵育 20 min。孵育后，我們加入500 ml的細胞培養基并合并所有細胞層的接種物。我們抽取一部分細胞樣品用細胞血球計數器計數。使用臺盼藍染色（0.1%臺盼藍溶于PBS）測定細胞活率。下一步，我們測定達到特定接種密度所需要的懸浮細胞量，然后轉移瓶中的細胞通過無菌焊接加入到Cellbag中。
取樣 每天對細胞取樣以確定密度和形態。在取樣前，適當提高反應器的攪拌速率以保證微載體均勻懸浮 （對Cellbag-2 L為16 rpm和12°，對Cellbag-10 L為18 rpm和5°）。在提高攪拌速率2 min后，從取樣口取出4 ml載體懸液，同時反應器保持連續搖動。然后反應器的攪拌參數被恢復到細胞培養時的工作參數，將樣品轉移到離心管中。先沉降微載體，丟棄上清，將含有 Vero細胞的微載體重懸在1 ml 含有0.1%結晶紫的0.1 M檸檬酸溶液中，然后孵育1.5 h。釋放出的細胞核用血球計數器計數。對于MDCK 細胞，載體重懸在含有0.1%結晶紫的檸檬酸和Triton X-100溶液中。然后載體懸液被漩渦振蕩30 s，使用 Bürker chamber計數細胞核。
0.5 ml Vero細胞微載體懸液被轉移到小離心管中。在微載體沉降后，丟棄上清，貼在微載體上的Vero細胞使用0.3 ml蘇木紫溶液固定并染色。微載體在顯微鏡下放大100倍進行觀察，用于顯微拍照。
微載體培養的最佳工作體積 確定Cellbag-10 L和 Cellbag-50 L的最佳工作體積。培養袋中的推薦工作培養體積為最大推薦體積的40 %（即Cellbag-10 L為2 L，Cellbag-50 L為10 L）。微載體密度為3 g/l Cytodex 3，接種密度為0.3×106細胞/ml。對每種Cellbag和培養體積，分別測試以下搖動條件：10 rpm和5o、12 rpm和5o、14 rpm和5o和12 rpm and 6o。
微載體培養的最佳混合條件 對于工作體積為2 L的 Cellbag-10 L進行最佳混合的研究。在Cellbag-10 L中培養基和微載體在 37℃和 5%二氧化碳通氣下平衡 2 h。按照 0.3×106細胞/ml 的初始密度接種， 并在細胞-微載體貼附階段使用連續的搖動方式。細胞生長 18 h 達到大約0.6×106細胞/ml 的細胞密度后，以階梯方式逐漸提高搖動速度。在 5o、6o 和7o 下分別對初始搖速12 rpm進行測試。 搖速按照階梯方式每小時逐漸提高，直到細胞開始從微載體上脫落。
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