答：原因有很多：
a) 你的細胞中不表達這種蛋白質，換一種細胞；
b) 你的細胞中的蛋白質被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；
c) 你的抗體不能識別目標蛋白，多看看說明，看是否有問題。
答：a) 有沉淀可能因為你的蛋白沒有變性完全，可以適當提高SDS 濃度，同時將樣品煮沸時間延長；
b) 也不排除你的抗原濃度過高，這時再加入適量上樣緩沖液即可。
答：可以選擇0.2μml的膜，同時縮短轉移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉移。其他按步驟即可。
答：可以加大抗原上樣量。這是最主要的。同時也可以將一抗稀釋比例降低。
答：減少抗原上樣量，降低一抗濃度，改變一抗孵育時間，提高牛奶濃度。
答：你的一抗濃度較高，二抗上HRP 催化活力太強，同時你的顯色底物處于一個臨界點，反應時間不長，將周圍底物催化完，形成了空白即“反亮現象”。將一抗和二抗濃度降低，或更換新底物。
答：如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現在一抗和抗原制備上。
a) 二抗的HRP 活性太強，將底物消耗光；
b) ECM底物中H2O2，不穩定，失活；
c) ECL底物沒覆蓋到相應位置；
d) 二抗失活。
是什么原因呢?
答：a) 可能是紅燈造成的, 膠片本來就被曝光了，可以在完全黑暗的情況下操作.看是否有改善；
b) 顯影時間過長。
答：DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP 最敏感的底物；ECM結果容易控制，但被催化時靈敏度差一點，但如果達到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級抗原。要看你實驗的情況。
答：a)抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量，煮沸變性時間延長，可以打開二聚體；
b)蛋白本身的修飾如：糖基化，磷酸化等。
答：可能是：
a)樣品濃度過低；
b)轉移時間不夠。
答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時候是不用加的。
13. 要驗證某個細胞上有無該蛋白的存在，需要做免疫組化和western blot試驗嗎？做這兩個試驗時的一抗和二抗可以共用嗎？
答：① 免疫組化可以用來進行定位，但是不能精確定量，而且有時會有假陽性，不易與背景區分；Western blot可以特異性檢測某個蛋白質分子，進行定量，但是不能定位。
② 兩種實驗的一抗有時候不能通用，公司的產品說明一般都會說明可以進行什么實驗，在免疫組化時，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。
︶ 條帶呈笑臉狀
原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好; 電泳系統溫度偏高。
︵ 條帶呈皺眉狀
原因：可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全。
拖尾
原因：樣品溶解不好。
紋理（縱向條紋）
原因：樣品中含有不溶性顆粒。
條帶偏斜
原因：電極不平衡或者加樣位置偏斜。
條帶兩邊擴散
原因：加樣量過多。
膜封閉不夠
延長封閉的時間；選擇更加適合的封閉液。
一抗稀釋度不適宜
對抗體進行滴度測試，選擇最適宜的抗體稀釋度。
一抗孵育的溫度偏高
建議4℃結合過夜。
選擇的膜容易產生高背景
一般硝酸纖維素膜的背景會比PVDF膜低。
膜在實驗過程中干過
實驗過程中要注意保持膜的濕潤。
檢測時曝光時間過長
減少曝光時間。
目的蛋白有多個修飾位點（磷酸化位點、糖基化位點、乙酰化位點等），本身可以呈現多條帶。
查閱文獻或進行生物信息學分析，獲得蛋白序列的修飾位點信息，通過去修飾確定蛋白實際大小。
目的蛋白有其它剪切本
查閱文獻或生物信息學分析可能性。
樣本處理過程中目的蛋白發生降解
加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時在冰上操作。
上樣量過高，太敏感
適當減少上樣量。
一抗特異性不高
重新選擇或制備高特異性的抗體。
一抗不純
純化抗體
一抗或者二抗濃度偏高
降低抗體濃度。
可能的原因及建議
檢測樣本不表達目的蛋白
選擇表達量高的細胞作為陽性對照，用于確定檢測樣本是否為陰性。
檢測樣本低表達目的蛋白
提高上樣量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制劑。
轉移不完全或過轉移
可以用麗春紅染膜并結合染膠（考馬斯亮藍）后確定條帶是否轉至膜上或轉移過頭；適當調整轉膜的時間和電流。
抗體不能識別測試種屬的相關蛋白
購買抗體前應當認真閱讀抗體說明書，確定其是否能夠交叉識別測試種屬的對應蛋白。
一抗孵育時間不足
建議4℃結合過夜。
二抗與一抗不匹配
選擇針對一抗來源的種屬的抗體。
洗膜過度
洗膜時間不宜過長，加入的去垢劑不宜過強或過多，建議使用0.1%的弱去垢劑Tween-20。
膜上多處出現黑點或黑斑
原因：抗體與封閉試劑發生非特異性的結合。
反白（條帶顯白色）
原因：目的蛋白含量太高或者一抗濃度偏高。
蛋白分子量偏低或偏高
原因：膠濃度不適合，高分子量要用低濃度膠；小分子蛋白要用高濃度膠。
操作有毒試劑時，帶手套和口罩，且操作揮發性試劑應在通風櫥中進行。