affymetrix芯片實驗步驟－中文版

目 錄

第一章總 RNA 的純化（RNeasy? Kit）............................. 3

第二章由 RNA 合成雙鏈DNA.............................................. 4

一、反轉錄合成第一鏈cDNA............................................ 4

二、反轉錄合成第二鏈cDNA............................................ 5

第三章生物素標記 cRNA 合成............................................. 6

三、體外轉錄合成標記cRNA............................................ 6

四、aRNA 純化.................................................................. 6

第四章雜交、洗滌、染色、掃描芯片 .................................. 8

五、片斷化........................................................................... 8

六、雜交............................................................................... 8

七、洗滌、染色和掃描....................................................... 9

第一章總RNA的純化（RNeasy? Kit）

通常在使用TRIzol法抽提組織總RNA時，因為方法的限制，造成總RNA的純度降低，影響探針的標記和芯片雜交。所以需使用QIAGEN RNeasy Kit進一步的純化。詳細操作原理和方法見Rneasy Mini Protocol for RNA Cleanup。

1. 根據需純化的樣品數配制DNase I混合液，每個樣品需要80 μL的DNase I混合液，按10 μL DNase I的儲存液加入70 μL Buffer RDD配制。

2. 取經質檢合格的總RNA≤100 μg溶解于100 μL RNase-free的水中，再加入350μL Buffer RLT并充分混勻

3. 加入250 μL無水乙醇，Tip頭充分混勻。

4. 將共計700 μL含總RNA的溶液轉入套在2 mL離心管內的RNeasy mini柱子內，8,000 g離心15~30 s，棄去濾過液。

5. 加350 μL Buffer RW1到離心柱內。蓋上管蓋，8,000 g離心15 s，棄去濾過液。

6. 直接加入DNase I混合液（80 μL）到離心柱膜上，室溫放置15 min。

7. 加350 μL Buffer RW1到離心柱內。蓋上管蓋，8,000 g離心15 s，棄去濾過液。

8. 吸取500 μL Buffer PRE到RNeasy mini柱子內，8,000 g離心洗滌15 s，棄去濾過液，再用500 μL Buffer PRE在8,000 g離心洗滌2 min，棄去濾過液和2 mL套管，將RNeasy mini柱子轉入一新的1.5 mL Eppendorf管中。

9. 吸取40 μL RNase free的水，≥8000 g離心洗脫1 min。

10. 重復步驟9一次。

11. 測定OD值（通常OD數值在1.8~2.1之間）

第二章由RNA合成雙鏈DNA

一、反轉錄合成第一鏈 cDNA

1、準備Poly-A Control

按下表稀釋Poly-A Control：

表1.1