食品中大腸桿菌檢測方法研究

　　摘要:近年來，食品安全問題越來越受到人們的重視，在頻頻發生的食品安全事故中，大腸桿菌是主要的影響因素，是食品污染程度的重要參數指標，如何采用快速、可靠的方法來準確的檢測出食品是否被大腸桿菌所污染是至關重要的。本文提出了大腸桿菌的傳統檢測技術以及最新發明的生物化學檢測方法，以期為大腸桿菌檢測技術的研究提供參考。
　　大腸桿菌的生物學術語稱為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，是人及各種動物腸道中最主要的且數量最多的一種細菌，食品或水中大腸桿菌的檢出，則可認為是被糞便污染。它的出現可能意味著腸道病原菌的存在。大腸桿菌作為飲水與食品的糞源性污染衛生細菌學指標，已成為國際公認的衛生監測指示菌。本文研究的目的就在于探求快速、靈敏、可靠的檢測方法。
　　1、食品中大腸桿菌檢測的研究現狀
　　檢測大腸桿菌的傳統方法包括多管發酵法、濾膜法和平板計數法。多管發酵法成本低，檢測時間較長，容易影響測定結果的準確性；濾膜法與多管發酵法相比，操作較為簡單，主要用于檢測雜質較少的水樣，在檢驗渾濁度高、非大腸桿菌類的細菌密度大的水樣時，有其局限性；平板計數法成本較低，尤其是對檢測實驗室的硬件設備要求較低，這三種方法綜合來看，都存在檢測周期長、靈敏度低、程序繁瑣的缺點，難以滿足目前對食品安全快速檢測的要求。為了適應時代的要求，目前發明了一些新的快速檢測技術，主要包括氣相色譜(GC)和高效液相色譜(HPLC)技術、PCR技術、免疫磁珠技術、基因芯片技術等。
　　2、食品中大腸桿菌檢測的傳統方法介紹
　　2.1多管發酵法
　　多管發酵法是用來檢測水體中大腸桿菌的一種傳統方法，該方法是指多管發酵的大腸菌群陽性，在44.5℃的含有熒光底物的培養基上連續培養24 h，能產生分解熒光底物的β一葡萄糖醛酸酶，釋放出熒光產物，進而使培養基在紫外光源照射下產生特征性熒光。此方法可被用來對原樣品中的菌數作統計學估計。具體測定，一般涉及以下幾個試驗：首先是發酵試驗，在單料或雙料乳糖膽鹽發酵管內進行；其次是分離培養試驗，利用伊紅美藍平皿分離；然后是在乳糖發酵管中進行的二次發酵試驗，最后通過革蘭氏染色、芽抱染色、顯微鏡觀察等試驗來完成。多管發酵法成本低，試驗要求不高，但是檢測時間較長，容易受其他因素干擾，進而影響到測定結果的精確度。
　　2.2濾膜法
　　所謂的濾膜法是指用孔徑為0.45微米的濾膜將水體進行過濾，把水體中含有的細菌截留在濾膜上，將濾膜放在37℃的含有品紅硫酸鈉的培養基上進行24h的培養，因腸菌群可發酵乳糖而使濾膜出現具有金屬光澤的紫紅色菌落，直接計數濾膜上的大腸菌群茵落，就可計算出單位樣品中含有的大腸桿菌數。
　　2.3平板計數法
　　該方法的具體步驟是首先將樣本做一定倍比的稀釋，其中的微生物被稀釋后分散成單個細胞，然后在一定的條件下進行培養一直到生長成能用肉眼觀察的菌落，最后通過樣本數量和稀釋度來計算出單位樣本中的菌數。
　　3、食品中大腸桿菌檢測的新方法
　　隨著科學技術的突飛猛進，傳統的用于檢測大腸桿菌的技術越來越難以滿足食品安全檢測的需求，一些新的檢測技術應運而生。
　　3.1氣相色譜(GC)和高效液相色譜(HPLC)法
　　氣相色譜法的主要思路是將大腸桿菌經過一系列衍生化處理后，為氣相色譜儀的分析研究提供盡可能多的化學組分。頂空氣相色譜法主要是用來分析大腸桿菌的污染程度，其主要原理就是利用食品密封系統頂部的微生物來發揮代謝產物CO2，進而對微生物進行分析和鑒定。該方法對食品質量及食品安全評價有重大意義。與上述所提到的傳統技術相比，此種方法具有靈敏度高、檢測速度快的優點。
　　高效液相色譜法主要是根據離子配對反相層析的原理來分析核酸。該技術主要是針對DNA片段的分離。DNA鏈的長度越長，所攜帶的磷酸基團就越多，就會有更多的TEAA與之相融合，增加其在柱內停留的時間。因乙睛具有親水特性，可以通過增加其濃度而達到將DNA分離的目的，在具備一定的變性溫度條件下，可通過圖譜顯示明顯的吸收峰。這一技術具有靈敏度高、準確度高、成本低等優點，可以大大提高工作效率。
　　3.2聚合酶鏈式反應(PCR)技術
　　聚合酶聯反應(PCR)是通過基因擴增技術來檢測菌落的方法，其基本原理是通過放射性同位素如：磷、硫或碳的同位素或其他標記物來標記特異核苷酸片段來制備探測針，用于檢測那些難于培養或不能通過人工培養的菌落。就目前的食品檢驗試驗來看，一般將其與氧化酶法相結合，這樣更有利于保證檢測結果的準確性和可靠性。但就該方法來講，樣品的提純化處理需要較長的時間，并且對操作人員的專業知識也有較高的要求。
　　3.3酶聯免疫分析法(ELISA)
　　該方法的基本原理是在不損壞抗原或抗體的免疫活性的條件下提前將其結合到某種固相載體的表面，進行測定時，將要檢驗的樣品按照一定的程序與結合在固相載體表面的抗原或抗體進行化學反應進而生成抗原或抗體復合物。反應結束后將反應液以外的其他物質經洗劑后去除，然后加入酶反應底物，底物在固相載體上的酶的催化作用下發生變色反應，形成變色產物，最后通過有色物的量來確定單位樣品中被檢物的含量。由于酶具有較高的催化效率，大大提高了測定的靈敏度。
　　3.4免疫磁珠技術(IMS)
　　免疫磁珠技術也是目前比較常見的一種大腸桿菌的分離技術，其主要思路是將抗體偶聯在磁性顆粒表面，以磁作為抗體的載體，與樣品中的被檢物相結合，在磁場的作用下，載有致病微生物的磁性微球向磁極方向移動，進而將大腸桿菌進行分離。與常規檢驗方法相比，免疫磁珠技術的優點更為突出，它適用于在各種各樣的菌種的樣本中快速分離出目的微生物。該方法如果與上述的PCR、酶聯免疫技術等技術相結合，則會在很大程度上提高檢測效率。
　　3.5基因芯片技術
　　基因芯片技術起源于20世紀90年代，也稱之為DNA微陣列或寡核苷酸陣列。該技術用于檢測各種環境或媒介中的微生物。其基本原理是將微生物樣品DNA通過PCR擴增后制備熒光標記探針，固化于支持物表面上，,產生二維DNA探針陣列，然后與芯片上的寡核苷酸點進行雜交，最后通過檢測雜交信號來確定檢測樣品中特定微生物的存在。由于該技術中常采用硅芯片作固相支持物,并且還運用了計算機芯片的制備技術,所以稱之為基因芯片技術。
　　與傳統的檢測方法相比，基因芯片技術化，具有顯著的優點，主要體現在自動化、操作簡便快速、特異性強、敏感性高等方面，可以說該技術是食品安全方面的一個重大突破。但是基因芯片技術也存在不足之處：其一，該方法檢測中所用到的儀器、設備其費用極其昂貴；其二，檢測過程中，基因擴增時容易被污染，進而影響到檢測的結果；其三，樣品的制備及標記技術較為復雜；其四，該技術的操作對工作人員的專業素質有較高要求。
　　4、結語
　　隨著科學技術的不斷進步，對食品中大腸桿菌的檢測速度和精度都提出了更高的要求，我們只有不斷的改進、完善相關的測定技術，才能適應現代的要求，才能有效的解決食品安全問題，為人類的生活提供有力保障。
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