CasRx在動物體內靶向沉默RNA的應用成果

　　該研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA組合，通過尾靜脈注射質粒的方式，將CasRx系統和靶向Pten基因的sgRNA導入到小鼠肝臟細胞中，成功在小鼠肝臟中實現了Pten的高效沉默，證實了CasRx系統在成體動物體內也具有靶向沉默RNA的活性，通過增強下游蛋白AKT的磷酸化，影響了糖脂代謝相關基因的表達。

　　2020年3月18日，《蛋白質與細胞》期刊在線發表了《Cas13d介導的肝臟基因表達下調對代謝功能的調控》的研究論文，該研究由中科院腦科學與智能技術卓越創新中心（神經科學研究所）、上海腦科學與類腦研究中心、神經科學國家重點實驗室楊輝研究組和上海科技大學生命科學與技術學院黃鵬羽研究組合作完成。該研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA組合，通過尾靜脈注射質粒的方式，將CasRx系統和靶向Pten基因的sgRNA導入到小鼠肝臟細胞中，成功在小鼠肝臟中實現了Pten的高效沉默，證實了CasRx系統在成體動物體內也具有靶向沉默RNA的活性，通過增強下游蛋白AKT的磷酸化，影響了糖脂代謝相關基因的表達。同時，利用AAV遞送CasRx和靶向Pscsk9的sgRNA到小鼠肝臟，有效降低了肝臟中PCSK9的蛋白表達，以及小鼠血液中的膽固醇水平。這為治療后天性的代謝疾病提供了新方案。

　　同時，楊輝研究組與上海交通大學醫學院附屬上海第一人民醫院孫曉東研究組合作，也探究了CasRx預防嚴重的眼部疾病——年齡相關性黃斑變性（AMD）的可能性，研究人員發現在體內使用CasRx敲低Vegfa的mRNA可以顯著減少AMD小鼠模型中脈絡膜新血管形成（CNV）的面積，驗證了將RNA靶向的CRISPR系統用于治療應用的潛力。相關研究論文《CasRx介導的RNA靶向策略可防止年齡相關的黃斑變性的小鼠模型中的脈絡膜新生血管形成》3月3日在《國家科學評論》在線發表。

　　近年來，CRISPR/Cas9技術因其強大且便捷的DNA編輯能力而受到廣泛關注。2016年，張鋒實驗室發現了一種新的Cas蛋白Cas13a，可以靶向RNA進行切割。之后人們又陸續發現了靶向RNA的Cas13b, Cas13c。由于Cas13家族蛋白靶向RNA的特點，理論上在一些特定疾病的檢測和治療上具有獨特優勢，因而成為近年來的研究熱點。2018年，加州大學伯克利分校Patrick Hsu實驗室發現了Cas13d家族。他們發現與RNA干擾技術相比，Cas13d介導的基因沉默具有更高的特異性（與數百個shRNA脫靶相比，Cas13d沒有脫靶）和敲除效率（Cas13d達到96％，shRNA達到65％）。而與Cas9介導的基因敲除技術相比，Cas13d介導的基因沉默不會改變基因組DNA，因此這種基因沉默是可逆的，從而對一些后天性疾病（如因不良生活習慣導致的高血脂等后天代謝性疾病）的治療更有優勢。其中Cas13d家族的CasRx蛋白由于體積小，效率高，被認為是在未來應用中最具有優勢的Cas13蛋白。

　　此前的工作都在細胞水平證明了CasRx的高效性和特異性，楊輝研究組的這兩篇文章則更進一步在動物體內證明了CasRx的活性，為臨床提供了可能性。為證明CasRx在動物體內的活性，研究人員分別針對目的基因進行了sgRNA的體外篩選，然后采用尾靜脈注射敲低Pten的質粒、尾靜脈注射敲低Pcsk9的AAV8病毒、眼部注射敲低Vegfa的AAV病毒。對注射后的小鼠進行相應分析，分別得到Pten基因下調及其下游蛋白AKT的磷酸化上調，Pcsk9下調造成血清膽固醇下調；Vegfa下調顯著減少AMD小鼠模型中脈絡膜新血管形成（CNV）的面積。

　　《蛋白質與細胞》的工作由中科院腦智卓越中心博士研究生賀冰冰、黃佳，上海科技大學博士研究生彭文博等科研人員，在上海科技大學生命科學與技術學院黃鵬羽研究員和中科院腦智卓越中心楊輝研究員共同指導完成。《國家科學評論》的工作由腦智卓越中心博士研究生周昌陽、胡新德、唐騁，上海第一人民醫院劉文佳，腦智卓越中心楊輝組博士后王少冉等科研人員，在中科院腦智卓越中心楊輝研究員、中科院腦智卓越中心博士后周海波與上海交通大學醫學院附屬上海第一人民醫院孫曉東教授共同指導完成。這兩項工作得到了腦智卓越中心流式平臺，上海科技大學分子細胞技術平臺和成像平臺，上海交通大學醫學院附屬上海第一人民醫院的大力協助。這兩項工作得到了中國科學技術部、國家自然科學基金、中國科學院、上海市的項目資助。