9、什么叫復性成功
復性效果的檢測：
根據具體的蛋白性質和需要，可以從生化、免疫、物理性質等方面對蛋白質的復性效率進行檢測。
1，凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測變性和天然狀態的蛋白質，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測有二硫鍵的蛋白復性后二硫鍵的配對情況。
2，光譜學方法：可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態下的光譜學特征進行復性情況的檢測，但一般只用于復性研究中的過程檢測。
3，色譜方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于兩種狀態的蛋白色譜行為不同，
4，生物學活性及比活測定：一般用細胞方法或生化方法進行測定，較好的反映了復性蛋白的活性，值得注意的是，不同的測活方法測得的結果不同，而且常常不能完全反映體內活性。
5，黏度和濁度測定：復性后的蛋白溶解度增加，變性狀態時由于疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見的沉淀析出。
6，免疫學方法：如ELISA、WESTERN等，特別是對結構決定簇的抗體檢驗，比較真實的反映了蛋白質的折疊狀態。
在正常的生理條件下，組成蛋白質的多肽鏈都能以獨特的方式進行折疊，形成自己特有的空間結構，以執行某一些生命活動。當外界環境改變時，可能造成基因突變和蛋白質序列改變，錯誤剪接和運輸，錯誤折疊和異常聚積，形成對機體有害的反應，引起構象病的發生和無生物活性、不可溶的包涵體形成。目前對包涵體形成和復性過程中發生聚集的機制尚不清楚，許多已建立的高效復性方法是在反復實驗和優化的基礎上建立的，且沒有普遍性，但從這許許多多的個例中發現了一些規律：如聚集的發生是由鏈間的疏水相互作用介導、聚集具有相對特異性、折疊中間體可能具有不同的作用等等，并利用這些知識建立了一些重組蛋白質高效復興性的方法。相信隨著結構生物學、生物信息學、蛋白質工程學及相關新技術和新設備的發展和完善，在不久的將來，預測和設計最佳復性方案將成為可能。
另外，還向這位戰友薦一文章，有關包涵體蛋白復性的文章！
10、怎樣鑒定融合蛋白復性是否成功
問：最近在做GST融合蛋白的純化，由于目的蛋白主要存在于包涵體中，所以在變性條件下將包涵體溶解，經復性，透析后用GSH sepharose 4B純化，結果得到了比較純的融合蛋白，這是否說明GST的活性已得到恢復（因為能與GSH結合），請問這種情況下，是否能代表我的目的蛋白的活性也得到了恢復？由于我的目的蛋白只是一個蛋白的某一段，不具有酶活性，也不是什么受體之類的，所以不知如何鑒定它的活性。
如果我得到的是變性的融合蛋白，那么用于制備多抗或者單抗會有影響嗎？
如果我的融合蛋白是可溶性的，那么用GSH sepharose 4B純化得到的融合蛋白可以直接用于制備多抗嗎？溶液中的GSH，Tis等成分對免疫動物有影響嗎？是否需要透析除取這些成分才能去免疫動物呢？
答：1）。不可以。GST 具體多大忘記了，但做為TAG 使用的蛋白一般是很小的一段AA，可以用相對應的抗體做PULL DOWN，親和純化等。但蛋白的活性是需要構象存在的，一小段TAG 空間結構幾乎沒有，就算是沒有恢復活性的蛋白也可以與這小段AA 對應的抗體結合。
2）。變性蛋白只是天然蛋白伸直的了產物，用來免疫動物具有更強的抗原性。只是天然蛋白中被包在內部的抗原決定簇也會暴露出來，如果用該變性抗原制備的抗體來檢測變性抗原是可以的，如果用來檢測天然蛋白，可能會有假陽性。做單抗也可以，同樣道理，篩選出的單抗可能對抗的抗原決定簇處于天然抗原的內部，是否能用還要看將來該單抗用來干什么。
3）。免疫動物要求抗原體種盡量小。在這種小體積的情況下，緩沖液里的小分子成分只要沒毒影響就不大，可以不用考慮。
4） GST為26kd,你得到的蛋白活性應通過 目的蛋白功能分析才能驗證是否復性。GST融合蛋白可以免疫動物，但抗體純化須用GSH-sepharose 4B 和蛋白A或G進一步純化，去掉抗GST抗體，如果你的目的蛋白很大，可以凝血酶切割除去 ＧＳＴ，再免疫動物.GSH,Tris 是小 分子，沒影響。
5） 既然目的蛋白沒有活性，何來得活性鑒定，復性是否成功，就主要是看是否恢復到原來特有的三級結構，這就要看你目的蛋白的特異性，和天然的目的蛋白片斷進行比較，看其復性是否徹底，這必須有個對照，才能知道復性是否完全。不知道你得到目的蛋白有什么用處，如果是用來做抗原，就沒有必要進行活性鑒定了。
變性的融合蛋白做抗原是沒有影響的，gst的分子量是26kda，當然，如果將融合伴侶除去，抗體的特異性會要更好一些，如果不除，影響也不會很大。最好進行透析，除去溶液中的雜物質，但是Tris沒有什么關系，其就如同PBS一樣，本身是緩沖體系，不會對免疫造成太大影響。
6） 做抗原的話，變性了沒關系的；純化后可以直接免疫動物，我們這就有人做，不過他是用的His融合表達；掛著GST挺好的，不切也行，蛋白大些豈不是抗原性更強些
另外，你看沒看過菌液上清里的蛋白量？那里可能有許多的有活性的蛋白呀
五、包涵體的純化
復性以后的蛋白質的純化策略與可溶性蛋白質相似，這里不再贅述。（注：當然也可以先純化然后再復性———一般多采用凝膠柱，或者純化與復性同步進行———比如柱上復性。）
六、綜述以及其他
1、蛋白復性和純化在線資料
1. 包涵體表達的蛋白的復性 http://www.sinobio.net/method/ecoli.htm#1
2. 重組蛋白純化方法
組織細胞的破碎 http://www.sinobio.net/method/sansheng/dissociation.htm
目標蛋白的粗提 http://www.sinobio.net/method/sansheng/extracting.htm
蛋白質沉淀方法 http://www.sinobio.net/method/sansheng/precipitation.htm
色譜分離 http://www.sinobio.net/method/sansheng/chromatogram.htm
2、綜述
蛋白的復性是一個世界性的難題，沒有通用的方法，甚至沒有靠得住的規律，只能試。
包涵體表達的蛋白的復性包涵體表達的蛋白的復性
包涵體：
包涵體是指細菌表達的蛋白在細胞內凝集，形成無活性的固體顆粒。
包涵體的組成與特性：
一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，環狀或缺口的質粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0.5-1um，難溶與水，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。
包涵體的形成：
主要因為在重組蛋白的表達過程中缺乏某些蛋白質折疊的輔助因子，或環境不適，無法形成正確的次級鍵等原因形成的。
1、表達量過高，研究發現在低表達時很少形成包涵體，表達量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至于沒有足夠的時間進行折疊，二硫鍵不能正確的配對，過多的蛋白間的非特異性結合，蛋白質無法達到足夠的溶解度等。
2、重組蛋白的氨基酸組成：一般說含硫氨基酸越多越易形成包涵體，而脯氨酸的含量明顯與包涵體的形成呈正相關。
3、重組蛋白所處的環境：發酵溫度高或胞內pH接近蛋白的等電點時容易形成包涵體。
4、重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。因此有人采用共表達分子伴侶的方法以增加可溶蛋白的比例。
包涵體表達的有利因素：
1、可溶性蛋白在細胞內容易受到蛋白酶的攻擊，包涵體表達可以避免蛋白酶對外源蛋白的降解。
2、降低了胞內外源蛋白的濃度，有利于表達量的提高。
3、包涵體中雜蛋白含量較低，且只需要簡單的低速離心就可以與可溶性蛋白分離，有利于分離純化。
4、對機械攪拌和超聲破碎不敏感，易于破壁，并與細胞膜碎片分離。
破菌：
1、機械破碎
2、超聲破碎
3、化學方法破碎
分離：
1、離心：5000-20000g15min離心，可使大多數包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離。
2、過濾或萃取方法：
洗滌：
由于脂體及部分破碎的細胞膜及膜蛋白與包涵體粘連在一起，在溶解包涵體之前要先洗滌包涵體，通常用低濃度的變性劑如2M尿素在50mM TrispH7.0-8.5左右,1mMEDTA中洗滌。此外可以用溫和去垢劑TritonX-100洗滌去除膜碎片和膜蛋白。
溶解：
常用的變性劑有尿素（8M）、鹽酸胍（GdnHCl6-8M），通過離子間的相互作用，破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果少差，異氰硫酸胍（GdnSCN）最強。
去垢劑：如強的陰離子去垢劑SDS，可以破壞蛋白內的疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白。問題是由于SDS無法徹底的去除而不允許在制藥過程中使用。
極端pH：可以破壞蛋白的次級鍵從而增溶蛋白。如有人在pH>9.0溶解牛生長激素和牛凝乳蛋白酶包涵體。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。這些方法只適合于少部分蛋白的增溶。
變性劑的使用濃度和作用時間：一般在偏堿性性的環境中如pH8.0-9.0，尿素在堿性環境中不穩定，一般不要超過pH1.0。有些蛋白只能用鹽酸胍如IL-4。增溶時一般室溫過夜，但鹽酸胍在37度1小時便可以使多數蛋白完全變性溶解。