北大白凡組解釋持留菌耐藥的新機制

　　病原菌在抗生素或其他脅迫下常常采用休眠策略以過渡極端環境，這一類休眠的亞分類菌被成為持留菌（persister）。例如結核桿菌持留菌在病變組織內可形成硬結灶或結核結節，在機體抵抗力低下時可再次發生繼發性肺結核。近年來，關于持留菌形成的具體機制和應對策略已成為微生物研究領域的熱點。

　　在2016年，北京大學白凡課題組在Molecular Cell撰文報道持留菌在休眠過程中仍可以通過菌體內外排系統拮抗抗生素處理。而在抗生素治療中同時附加細菌外排抑制劑可以有效減少持留菌【1】。

　　2018年11月21日，白凡課題組繼續在Molecular Cell發表題為ATP-Dependent Dynamic Protein Aggregation Regulates Bacterial Dormancy Depth Critical for Antibiotic Tolerance 的研究論文。該研究發現，持留菌在休眠中受ATP豐度調控可以形成蛋白聚集體（Protein Aggregation），其可作為持留菌休眠的深度的指標（dormancy depth）。該聚集體的解聚同樣參與了細菌解除休眠的過程。研究人員進一步發現DnaK-ClpB可促進蛋白聚集體的解聚，對其干預可減少持留菌從休眠中復蘇，從而減弱細菌的耐藥性。

　　研究人員首先發現同種大腸桿菌E.coil在應對抗生素處理后可有休眠深度（dormancy depth）的差異，其主要表現為持留菌復蘇時間不同。而該休眠深度與細菌內蛋白聚集體形成具有相關性。研究人員利用明場顯微鏡觀察到E.coil內可有暗焦點（dark foci）形成，經驗證為蛋白的聚集體。通過質譜鑒定和通路分析，發現早期的聚集體內主要有核糖體蛋白及氧化代謝相關蛋白，而在晚期的聚集體內含有大量DNA復制和修復蛋白。

　　研究人員使用氯霉素感染細菌蛋白合成后，可以減少蛋白聚集體形成，同時也減少了細菌進入休眠狀態。通過檢測細菌休眠后菌體內pH值和ATP水平，研究人員發現隨休眠深度增加，菌體pH值逐漸下降，ATP也呈現下降趨勢。更為重要的是，通過人為干預降低菌體內ATP水平可減少聚集體形成，而降低pH值無此效應。

　　既往研究中發現，DnaK和ClpB參與了E.coil蛋白聚集體的解聚【2, 3】，DnaK可結合到聚集體上，并募集解聚酶ClpB參與該過程。研究人員通過熒光定位可觀察DnaK和ClpB定位于聚集體中。為繼續驗證機制，研究人員構建了ΔdnaK和ΔclpB突變株。在休眠過程中，ΔdnaK和ΔclpB突變株可形成更多的持留菌進入休眠，但能完成解聚完成復蘇的持留菌數量明顯減少。研究人員繼續構建了DnaK ATP酶活性缺失的突變株（T199A和R261C），此兩株細菌在休眠中無法看到DnaK聚集于蛋白聚集體中，且細菌復蘇能力也明顯下降。這些證據證實，DnaK-ClpB參與了細菌從休眠到復蘇中聚集體的解聚過程，該過程依賴于DnaK 的ATP水解活性，而干預這一過程可降低持留菌的復蘇。

　　該研究幫助我們進一步理解了持留菌在休眠和復蘇過程中蛋白質狀態的變化，證實蛋白聚集體形成和解聚是持留菌休眠和復蘇的關鍵因素。DnaK-ClpB參與蛋白聚集體的解聚，通過干預復蘇過程中蛋白聚集體的解聚可減少持留菌的復蘇比例。這為細菌耐藥性研究和治療頑固性病灶中持留菌提供了新的治療思路。

　　參考文獻

　　1. Pu Y, Zhao Z, Li Y, Zou J, Ma Q, Zhao Y, et al. Enhanced Efflux Activity Facilitates Drug Tolerance in Dormant Bacterial Cells. Molecular cell 2016；62(2):284-94.

　　2. Rosenzweig R, Moradi S, Zarrine-Afsar A, Glover JR, Kay LE. Unraveling the mechanism of protein disaggregation through a ClpB-DnaK interaction. Science 2013；339(6123):1080-3.

　　3. Seyffer F, Kummer E, Oguchi Y, Winkler J, Kumar M, Zahn R, et al. Hsp70 proteins bind Hsp100 regulatory M domains to activate AAA+ disaggregase at aggregate surfaces. Nature structural & molecular biology 2012；19(12):1347-55.