1. 對于每組測序反應，標記四個0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml適當的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(約20ml)礦物油，蓋上蓋子保存于冰上或4℃備用。
2. 對于每組四個測序反應,在一個eppendorf管中混合以下試劑：
（1） 樣品反應：
質粒模板DNA 2.1pmol
5×測序緩沖液 5ml
引物4.5pmol
無菌ddH2O 至終體積16ml
（2）對照反應
pGEM-3Zf(+)對照DNA(4mg)
4.0ml
5×測序緩沖液 5ml
pUC/M13正向引物(4.5pmol) 3.6ml
無菌ddH2 O 至終體積 16 ml
3. 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml測序級Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸動幾次混勻。
4. 從第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一個d/ddNTP混合物的管內。
5. 在微量離心機中離心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。
6. 把反應管放入預熱至95℃的熱循環儀，以[注意]中循環模式為基準，開始循環程序。對于每個引物/模板組合都必須選擇最佳退火溫度。下列程序一般能讀出從引物開始350堿基的長度。
7. 熱循環程序完成后，在每個小管內加入3μl DNA測序終止溶液，在微量離心機中略一旋轉，終止反應。