DNA序列分析（DNA sequencing） 應用各種突變檢測技術檢測到的基因突變，最后都需用序列分析才能確定突變類型及突變位置，其效率可以達到100％。現在的測序方法已與經典的方法有了很大的不同，其基本原理雖仍是雙脫氧終止法，但自動化程度大為提高，操作更簡便，測序時間也大大縮短。隨著PCR技術與測序聯合使用，不需經過M13亞克隆步驟，故稱為直接測序法（direct sequencing,DS）。DS法測序的模板主主要來源于PCR，應用不對稱PCR（asymmetric PCR）和基因組擴增轉錄同步測序法（genomic amplification with transcript sequencing,GAWTS）等，使單鏈產物大大增加。近年來，PCR循環測序法的建立，使模板擴增與同步進行，引物用四種不同前顏色的熒光標記，使每個樣品的四個測序反應可在一個反應管和一個泳道內進行，大大提高了測鄧的自動化程度。目前PE公司推同出的DNA自動測序儀已發展到96泳道，并仍在不斷改進。這些高度自動化的測序方法是經較理想的基因突變分析技術，但其昂貴的費用其使用范圍，所以對一些小樣本或為了某些特定目的的樣本分析，仍進行經典的手工測序。
突變基因的檢測方法多種多樣，特別是PCR技術誕生后，許多檢測技術都是在PCR基礎上衍生的。由于PCR擴增南非要的模板量少，使對腫瘤的突變分析可以精確到單細胞，如霍奇金病的R-S細胞的單細胞基因突變分析。另外，應用顯微解剖法（microdissection）可在組織切片上較精確地挑選需檢測的靶點，其優點是可克服腫瘤組只中間質或癌周組織的混雜，提高準確性。除上述介紹的方法外，還有多種方法也用于基因突變的分子檢測，如對未知突變基因進行分析的酶促切割錯配法（enzyme mismatc cleavage,EMC）、切割片段長度多態性（cleavage fragment length polymor phism,CEFLP）、雙脫氧指紋圖譜法（dideoxy finger printing,ddF）、錯配接合蛋白質截短測試法（protein truncation test,PTT）等。對已知突變基因進行分析 的有引物延伸法（primer extension,PEX）、寡核苷酸鏈接檢測法（oligonucleotide ligation assay,OLA）、毛細管電泳法（capillary electrophoresis,CE）等方法。
用毛細管電泳技術檢測DNA點突變
作者 樊興君 金由辛
(中國科學院上海生物化學研究所、分子生物學國家重點實驗室，上海 200031)
毛細管電泳(CE)是90年代初發展起來的新技術，具有分辨率高、重現性好、靈敏度高、快速和易于實現自動化的特點。后來又發展了激光誘導熒光檢測器(LIF)，大大提高了分析靈敏度，對微量樣品如單細胞分析等，具有很大的優勢。
通常，利用CE技術可以在20min內分析完成幾千個堿基的DNA片段。CE可以應用于DNA點突變的檢測，目前在PCR基礎上利用CE技術對DNA已知點突變及未知點突變的檢測發展十分迅速。
1. 已知點突變的檢測
1.1 擴增抗拒突變系統PCR(ARMS-PCR)和短串聯重復PCR(STR-PCR) ARMS-PCR和STR-PCR在檢測已知點突變中愈來愈受到重視，尤其是用來診斷特殊遺傳疾病和癌癥。兩種分析方法都包括利用可以辨別單堿基突變(ARMS-PCR)或者具有簡單序列的不同數量的重復片段(STR-PCR)的引物進行專一性基因片段PCR擴增。CGE和ESCE都可以分析在ARMS-PCR基因PCR擴增中的單堿基取代產物。選擇合適的多組PCR引物對可以同時對多個突變位點進行分析，Donohoe等［1］利用多重ARMS-PCR擴增反應鑒定了阿樸脂蛋白E基因。對于雜合子樣品，STR-PCR 有一定困難，這包括長等位基因低的擴增效率和PCR擴增受阻(如非轉一性片段的擴增)，這兩種情況都會引起低的擴增條帶。傳統凝膠電泳需要放射性標記來進行分析。利用ESCE方法，LIF檢測器，在10min內對這種類型的PCR擴增產物4個堿基差別的DNA片段做到基線分離，體現了CE在這方面分析中的出色優勢。高靈敏度的LIF和高分離度的CE可以提供一個取代傳統凝膠電泳的一個有效工具。
1.2 連接酶鏈式反應(LCR) LCR是一種點突變檢測反應接著進行信號擴增的技術。在基因突變誘發人體疾病的程序性分析中十分有用。LCR反應中采用了兩對互補寡核苷酸引物，如果引物的序列與目標序列能完全配對時，那么兩對引物將與各自目標片段雜交，并連接；如果點突變出現在目標片段上時，將不能進行連接反應，就不會出現連接產物。Grossman等［2］利用ESCE快速分析了用于診斷膀胱纖維變性疾病的LCR產物，該方法也診斷了leber's遺傳性光纖神經疾病。利用CE分析的時間大約是傳統凝膠電泳的十分之一。用靈敏的LIF檢測器可以做微量LCR分析，同樣可以應用于分析那些紫外光可損DNA的分析。
1.3 等位基因特異性擴增分析(ASA) ASA是一種點突變的檢測方法，兩種寡核苷酸引物被用在PCR反應中。如果引物的序列與目標等位基因序列完全配對，那么引物在目標片段上雜交并變成PCR擴增；如果點突變發生在目標片段上時，則無擴增產物出現。單道及多道的CGE已經用于快速提供ASA基因圖譜的分析工作。Barta等［3］利用CGE及LIF檢測器分析了多重ASA反應，對先天性腎上腺增生患者21-hydroxylase基因的多個突變位點進行檢測。將多重PCR定量擴增同CE連接將提高分辨率和速度，優越于任何現在使用的手段。
1.4 限制性片段長度多態性分析(PCR-RFLP) PCR-RFLP是一種廣泛用于檢測已知DNA點突變的方法，它可以檢測大到幾千個堿基對DNA片段。該方法通過分析核酸限制性內切酶切割經目標模板PCR擴增的DNA片段上突變基因位點的有效性來分析DNA點突變。PCR-RFLP的分析可以利用CGE或ESCE，可以利用UV檢測或LIF檢測。ESCE被用在PCR-RFLP中檢測病毒種系及分析通常在大量癌癥病人和許多白血病衍生型病人中的K-ras locus DNA片段的基因突變位點［4］，CE在分析過程中遠優于傳統的葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠電泳。
2. 檢測未知點突變
2.1 定量反轉錄PCR 在疾病狀況下，特殊基因的突變活性影響病理的表現狀態。定量反轉錄PCR(QRT-PCR)可以通過從mRNA合成的cDNA接著PCR定量擴增cDNA來估測基因的活性和表達。特征cDNA產物通常用凝膠電泳檢測，定量方法或采用放射性同位素標記，或采用灰度掃描來完成。雖然自動DNA測序儀已被應用于QRT-PCR分析，但原位檢測、峰面積定量和自動數據處理等CE技術可以提供直接RNA-PCR反應技術［5］，而RNA-PCR反映了體內基因表達情況。重要的是，利用UV定量要比間接依靠掃描方法更為準確。
2.2 異源雙鏈核酸分子多態性分析(HPA) HPA廣泛用于檢測未知點突變。這種技術包括等位基因DNA片段變性(PCR-擴增)和接下來單鏈DNA分子重新退火形成一個原生型和突變型的雙鏈DNA(dsDNA)片段混合物。這個組成是一個重聚的同源雙鏈核酸分子(dsDNA)和新的異源雙鏈核酸分子(dsDNA)的混合物。異源雙鏈核酸分子出現的錯配現象歸因于結構的變化。在電泳過程中，異源雙鏈核酸分子滯后于同源雙鏈核酸分子。HPA依賴于DNA復制中局部結構的變化，隨著DNA片段長度和圍繞配對區域GC含量的增加，靈敏度會降低。
HPA已被成功地用ESCE進行分析，這種方法可以從同源雙鏈核酸分子片段中分辨出異源雙鏈核酸分子片段，其僅有一個堿基對錯配［6］。它可以用于快速檢測DNA突變而不需要進行DNA測序。通常傳統的分析方法受焦耳熱效應影響，要想將片段完全分離，整個分析過程大約需要4個小時，而CE技術卻可以在數分鐘內完成。
2.3 單鏈構象多態性(SSCP) SSCP也是一種分析未知點突變常用的方法。它包括雙鏈DNA片段的解離，每兩個單鏈片段依靠其特定序列組成一種折疊構象。SSCP分析的靈敏度依賴于是否突變影響到DNA的折疊和因此形成的單鏈DNA(ssDNA)分子在電泳中的移動速度。Atha等［7］利用ESCE結合SSCP分析了多組骨髓瘤患者P53腫瘤抑制基因372bpPCR產物的點突變。利用CE柱后多重熒光標記方法(一次分析檢測多波長熒光)，可以一次對多組突變位點進行準確分析。突變DNA具有相似的電泳遷移性，但不同的熒光探針可以以其不同的信號加以區分。即使利用先進的高效多道聚丙烯酰胺測序技術，分析也往往需要9個多小時，用CE技術則可以在11～25min內完成。多道CE分析可以將許多不同樣品在同樣短的時間內(<1h)完成分析，效率更高。
2.4 化學裂解錯配分析(CMC)和酶裂解錯配分析(EMC) CMC和EMC都是檢測未知點突變的比較新的方法。這兩種方法都是提供主要的堿基錯配區，PCR粗產物可以直接用這兩種方法進行分析。通常，低吸收值的酶切產物需要放射性同位素標記PAGE分析，而CE則可以利用熒光標記的手段進行高靈敏度分析。Siles等［8］利用ESCE及LIF檢測器對EMC反應的異熱信號和PCR信號擴增兩種方法產生DNA片段進行分析，以此來鑒定堿基錯配位區。
2.5 變性梯度毛細管電泳(CDCE) CDCE是一種在變性梯度凝膠電泳(DGGE)方法上發展起來，對未知點突變進行分析的技術。被分析的dsDNA必須包括兩個差異區(domain)：一個50個堿基長度或G-C堿基對比例大的高熔溫度區和一個包括異源雙鏈核酸分子DNA錯配對的低熔溫度區域。在DGGE過程中，異源雙鏈核酸分子進入包含一種或多種變性劑的梯度膠中，異源雙鏈DNA分子鏈的裂解就會在錯配位點開始并快速向低熔區擴張，這樣就會極大地降低該分子在膠中的遷移速度。雖然DGGE對于突變點的檢測率還不清楚，理論上可以達到100%。
用固定濃度的變性劑(脲或甲酰胺)連同分離時可以升到的恒定溫度，或在分離過程中采用微機控制溫度不斷升高的方法(溫度程序)，CDCE已經達到對一個錯配堿基片段的分離。這些方法對于單堿基錯配分析非常靈敏，但最直接的應用可能性決定于序列的組成，也就是說，是否有一個富含G-C區。很顯然，一旦有一個G-C堆積(一個PCR引物的5′末端具有GC重復區)可以與PCR擴增產物或限制性片段相容，那么，出現的任何錯配都可以容易地被CDCE檢測。Cecilia等［9］利用ESCE技術檢測了exon 17b(R10066H、R1066C、F1052V)基因片段上的三個點突變位點和exon 14a(v868v、t854t)上的兩種形態；Muniappan等建立了利用溫度程序對人體基因突變進行分析的方法。
2.6 雙脫氧指紋分析(ddF) ddF是一種結合SSCP和Sanger雙脫氧測序法檢測未知點突變的方法，理論上可以檢測所有類型的未知點突變。在ddF方法中，Sanger測序反應完成與一個雙脫氧終止子(terminator)的反應產物通過非變性凝膠電泳來分析，通過分析獲得或失掉一個雙脫氧終止片段(雙脫氧組成的)和/或至少一種包含點突變的DNA片段(SSCP組成)的電泳移動性的轉變來判斷點突變。Felmlee等［10］利用非變性CGE技術，用ddF方法檢測了M.Tuber-culosis特異性擴增DNA片段單個點突變，對于單個樣品，CE可以在25min內完成。一個對比實驗表明，單柱CGE分析30個樣品用時15h，而用傳統聚丙烯酰胺凝膠電泳則需要36h。
CE是一個新發展起來的技術，它用于DNA點突變的檢測是近年興起的并迅速發展著的一個研究領域。它用于DNA點突變檢測仍具有很大的潛力，如Khrapko及其合作者最近報道的用CE雜交技術檢測DNA點突變，Piggee等報道的用單鏈寡核苷酸引物延伸及熒光標記方法檢測DNA點突變等［11］。要詳細了解CE檢測DNA點突變技術，可以參考Le等的綜述［12］。隨著CE自身分析技術的不斷改進和自動化程度的不斷提高，如自動樣品采集、制備、分析和數據處理，微柱快速分析的出現等，DNA點突變分析有望建立高準確度、高自動化的程序性分析方法。而程序性DNA點突變檢測在臨床診斷中具有十分重要的意義，也將會對生物化學及分子生物學等相關領域產生深遠的影響。■