大腸桿菌重組蛋白復性

實驗概要

       Invitrogen  公司的蛋白復性試劑盒（Protein Refording  Kit）能夠在弱酸性條件下溶解大腸桿菌中的包涵體重組蛋白，并在中性的環境中對溶解的蛋白透析兩次：第一次利用加入還原劑的透析液促使蛋白二硫鍵的正確形成，第二次除去多余的還原劑

實驗步驟

 1.        制備包涵體

1)        取上述含目的蛋白菌液，4℃，6500 rpm 離心 15 min，棄上清；

2)        將沉淀完全重懸于 0.1 倍菌液體積的 1 × IB 洗滌液，反復混勻；

3)         在細胞裂解的過程中將重懸的溶液置于冰上以防止蛋白受熱裂解，可選擇超聲波裂解或 French Press  法裂解細胞。其中超聲波裂解細胞是更廣泛應用的一種方法，但利用此方法細胞的裂解率較低，并且液不適用于大量細胞的裂解（超出 50  g）。無論選擇何種方法，都必須將細胞置于冰上；

4)        細胞裂解后在混和液中迅速加入蛋白酶抑制劑，每 40 mL 混和液加入 5 mL 的含有 EDTA 的蛋白酶抑制劑 Cocktail Set II 或 1mL 的蛋白酶抑制劑 Cocktail Set III（選做）；

5)        10000 rpm 離心 10 min 收集包涵體；

6)        棄上清，將沉淀（內有包涵體）用 0.1 倍菌液體積的 1 × IB 洗滌液完全重懸；

7)        重復步驟 5 收集沉淀；

8)        將上述沉淀再次用 0.1 倍菌液體積的 1 × IB 洗滌液完全重懸，并將重懸液轉移至重量已知的干凈的離心管中；

9)        10000 rpm 離心 10 min 收集包涵體，棄上清，并將離心管倒置在紙巾上以完全除去多余的液體；

10)    離心管稱重，減去管中以得到包涵體的凈重。一般來說，OD₆₀₀ 為3 時收集的菌液，并且不溶性蛋白在細胞中的含量為 10-40% 時，每毫升菌液中有 1-4 mg 的包涵體。

2.        蛋白的溶解和重新折疊

1)      根據包涵體的重量計算所需的溶解液量，溶解包涵體使其在溶解液中的濃度為 10-20 mg/ml，溶解液按如下配方在室溫下配制：

10 × IB Solubilization buffer       5 mL

ddH₂O                                    44.5 mL

30% N-lauroylsarcosine          0.5 mL

DTT                                         50 μL

Total                                        50 mL

2)      將配制的溶解液加入收集有包涵體的離心管中，輕微混和。大的片斷用槍頭反復打碎；

3)      室溫靜置 15 min；

4)      室溫 10000 rpm 離心 10 min 離心，轉移上清（內有溶解蛋白）于干凈的離心管中（避免碎片）。

3.        透析

1)      透析袋處理，過程如下：

                                  i.              把透析袋剪成適當長度（10-20 cm）的小段；

                                ii.              在大體積的 2%（w/v）碳酸氫鈉和 1 mmol/L EDTA（pH 8.0）中將透析袋煮沸10 min；

                              iii.              用蒸餾水徹底清洗透析袋；

                              iv.              放在 1 mmol/L EDTA（pH 8.0）中將之煮沸 10 min。冷卻后，存放于4℃，必須確保透析袋始終浸沒在溶液內。從此時起取用透析袋必須戴手套；

                                v.              用前在透析袋內裝滿水然后排出，將之清洗干凈；

2)      準備透析液（為樣品的 50 倍，如樣品量為 15 mL，則需透析液 750 mL，因透析兩次故共需透析液 1.5 L），按以下配方配制：

50 × IB dialysis Buffer         30 mL

ddH₂O                                  1.5 L

（1 M DTT ）                     150 μL

Total                                    1.5 L

3)      4℃透析至少 3 h 以上，換新的透析液繼續透析 3 h 以上；

4)      按上步驟制備透析液，但不加 DTT;

5)      用不加 DTT 的透析液再透析一次。

4.        氧化還原以促使二硫鍵的形成

為促使蛋白的二硫鍵的正確形成，可以在透析液中加入氧化劑和還原劑繼續透析，經常用的氧化還原劑為氧化性谷胱甘肽和還原性谷胱甘肽，比較經濟的方法是使用 CuSO₄ 或 NaSeO₃,但使用這種方法所形成的不正確的二硫鍵比前者高。因此本論文中使用氧化性谷胱甘肽和還原性谷胱甘肽。

1)      如上制備透析液，但加入氧化還原劑，于4℃保存（其中還原性谷胱甘肽和氧化性谷胱甘肽的濃度分別為 1 mM 和 0.2 mM）；

2)      繼續于4℃透析蛋白過夜；

3)      取樣檢測蛋白的活性；

4)      如有必要，繼續于室溫或37℃透析蛋白以提高二硫鍵的形成率。

另有一種替代的方法就是配制氧化性谷胱甘肽和還原性谷胱甘肽的濃縮液，并直接加到目標蛋白中，反應后透析再除去多余的氧化還原劑。

5.        陰離子交換樹脂除去 N-lauroylsarcosine

這一步一般來說是非必需的。因為實驗室中檢測發現經過透析后樣品中N-lauroylsarcosine  的水平只相當于溶解液中的 1%，不超過 0.003%。因此一般在用陰離子交換樹脂處理之前先檢測樣品中的 N-lauroylsarcosine  水平。并且使用此方法還要確信目的蛋白在實驗過程中不會和陰離子交換樹脂結合。

1)      準備陰離子交換樹脂，依次以濃度為 1 M 的 NaOH、ddH₂O、4M的乙酸、ddH₂O、50 mM的無菌 Tris-HCl（pH 7.5-8.0）清洗，并于50 mM的無菌 Tris-HCl（pH 7.5-8.0）中于4℃保存備用；

2)      計算所需的陰離子交換樹脂量，如樣品溶解液中 N-lauroylsarcosine的濃度為 0.3%，則陰離子交換樹脂的濃度應為 1.5% 即每 100 mL 蛋白樣品中應加入 1.5 mL 的陰離子交換樹脂；

3)      將計算好的陰離子交換樹脂加入蛋白樣品；

4)      室溫緩搖 15 min；

5)      用尼龍膜（0.45-1 μm）過濾除去陰離子交換樹脂；

6)      檢測樣品中 N-lauroylsarcosine 的含量，如有必要重復處理，檢測方法如下：

                                      i.              配制濃度為 0.3% 的 N-lauroylsarcosine 的儲存液，并用 ddH₂O稀釋至一系列的濃度梯度；

                                    ii.              以同樣的方法將待測蛋白樣品用ddH₂O稀釋，設置ddH₂O作為對照。每個樣品稀釋液的體積均為 0.5-1 mL；

                                  iii.              每毫升稀釋液中加入 100 μL 的濃度為 1 M 的 HCl；

                                  iv.              短時間渦旋震蕩并在室溫中溫育 5 min；

                                    v.              測定標準溶液的 OD₄₀₅ 并制作 N-lauroylsarcosine 的標準曲線，利用標準曲線對應確定待測樣品中的 N-lauroylsarcosine；

                                  vi.              利用激光動態光散射儀檢測蛋白是否復性。