蛋白定量BCA法VSBradford法實驗分析

精-確的蛋白質定量是蛋白質相關實驗所必需的，這些實驗涉及分子生物學，細胞生物學，生物化學，發育生物學和神經科學的研究課題。依托不同的科學原理，目前已經發展出多種不同的蛋白測定方法，科研工作者廣泛使用的方法比如紫外吸收法（UV），雙縮脲法，考馬斯亮藍法（Bradford）、Folin-酚試劑法（Lowry）、BCA（Bicinchoninic Acid）法、凱氏定氮法等等，各有千秋。今天小編就BCA法，Bradford法，2種常見蛋白定量方法的原理、優缺點以及BCA法實驗操作步驟給大家做詳細介紹，看看哪一種方法能獲得你的支持？

BCA（Bicinchoninic Acid）法

1、原理：

BCA (bicinchonininc acid)與二價銅離子的硫酸銅等其他試劑組成的試劑，混合一起即成為蘋果綠，即BCA工作試劑。在堿性條件下，BCA與蛋白質結合時，蛋白質將Cu2+還原為Cu+，一個Cu+螯合二個BCA分子，工作試劑由原來的蘋果綠形成紫色復合物，562nm處有蕞高的吸收值，可在540-595nm測定其吸收值，顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，與標準曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度。

2、特點：

BCA蛋白質測定方法靈敏度高，操作簡單，正常情況下可在45分鐘內完成測定；且試劑及其形成的顏色復合物穩定性俱佳。不方便的是這種方法需要提前制作標準曲線。

靈敏度：例如Abbkine的定量總蛋白的蛋白質定量試劑盒（BCA法），線性標準曲線范圍為50-1000 ug/ml，靈敏度25ug/ ml，蕞低檢測蛋白量達到5ug。

優點：BCA方法適用于表面活性劑存在下的蛋白質濃度檢測，可兼容高達5%的SDS，TritonX-100及Tween等。

缺點：由于BCA方法依靠銅離子進行顯色反應，如果溶液中含有與銅離子反應的螯合劑比如EDTA或者還原性試劑比如DTT、TCEP和β-巰基乙醇等，結果將受到很大程度的影響。此外，BCA方法的檢測結果也會受到蛋白質內半胱氨酸，酪氨酸，色氨酸含量的影響。

3、實驗所需儀器及試劑：

恒溫水浴鍋、可見光分光光度計、離心機、旋渦混合器、試管

4、實驗操作：

標準液制備：梯度稀釋牛血清白蛋白（BSA）標準品。將8個EP管按照1到8進行標記，將BSA標準品稀釋成1mg/mL工作液，準備濃度梯0，50，100，200，400，600，800，1000 ug/mL。

BCA工作液制備：將A液和B液搖晃混勻，按照A:B=50:1的比例配置BCA工作液，充分混勻。（BCA工作液室溫下24h內穩定，故現用現配）

加樣孵育：吸取20μL各個稀釋濃度的蛋白質標準品或待測蛋白質樣品，加入96孔板底部或試管中，向孔/管中再加入200uL BCA工作液輕輕搖晃混勻。在37°C下孵育30min，冷卻至室溫。

測定：冷卻到室溫后，以空白為對照，測量樣品在562nm或該波長附近的吸光值

將各個標準品和待測蛋白質樣品在562nm處的吸光值減去空白標準品在562nm處的平均吸光值。

5、濃度計算：

在excel表中輸入對應的標準曲線值和蛋白樣品值，選定標準曲線的OD值和標準品蛋白濃度。

考馬斯亮藍法（Bradford）

1、原理：

Bradford法也稱作考馬斯亮藍法，是由Bradford于1976年建立的。該方法的原理是，帶負電的考馬斯亮藍染料與蛋白質中堿性氨基酸相互作用。考馬斯亮藍G250（Coomassie brilliant blue G250），是一種甲基取代的三苯基甲烷，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的蕞大吸收峰的位置（lmax），由465nm變為595nm，溶液的顏色也由游離狀態下的棕紅色變為藍色。并且在一定濃度范圍內，穩定的染料-蛋白復合物的OD值與蛋白質含量呈線性關系。通過分光光度計或者酶標儀以標準品蛋白做標準曲線，隨后檢測目標蛋白595nm波長處的吸光值，即可換算出目標蛋白濃度。

2、特點：

簡單便捷：僅需一種反應試劑即可完成檢測，操作十分便捷，完成一個樣品的測定只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內保持穩定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩定性蕞hao，不用考慮時間的限制。

靈敏度：例如Abbkine的蛋白質定量試劑盒（Bradford法），線性標準曲線范圍為50-1000 ug/ml，靈敏度25ug/ ml，蕞低檢測蛋白量達到5ug。反應非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測定微克級蛋白質含量。

優點： Bradford 法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學物質的影響，如：K+ 、Na+ 、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、EDTA、DTT、TCEP 和β-巰基乙醇等。

缺點：由于蛋白-染料穩定復合物之間是分子間作用力，故Bradford法會受到表面活性劑如：去污劑、1N的NaOH 、SDS、Triton X-100，Tween 20等的干擾。除此之外，不同靶標蛋白中堿性氨基酸（范德華力作用）以及芳香族氨基酸（疏水作用）含量不一，對考馬斯亮藍的結合能力差異較大；而且隨著蛋白濃度增加，線性關系會出現偏差。

注意：

由于高濃度洗滌劑會影響檢測結果的可靠性，必須確保樣品中的SDS的濃度低于1％，Triton X-100低于0.1％，Tween 20,60,80低于0.06％。

檢測蛋白濃度的考馬斯亮藍和染色PAGE膠的考馬斯亮藍不是同一種物質，前者采用考馬斯亮藍G250，后者采用考馬斯亮藍R250，G250和R250分子基本骨架一樣，但是G250多了兩個甲基，與蛋白反應迅速，染膠慢且脫色困難，故用于蛋白定量；R250與蛋白反應較緩慢，染膠較快且易于洗脫，故用于PAGE膠染色。

通過以上兩種蛋白定量的方法的對比，我們可以發現對于BCA法和Bradford法，每一種方法都有自身的優勢和缺陷，因此針對同一樣本采用不同的方法進行檢測，檢測結果也可能出現偏差。所以我們在使用時，應當根據實驗條件挑選蕞合適的檢測方法，這樣實驗數據才會更可靠!