一、化學法和酶法細胞裂解微量的細胞裂解經常通過化學法或酶法或二者共同采用來完成。例如, 超聲和弗式細胞壓碎器 (Frenchpress 均質機) 都不便于用在收集小于或等于 5 mL 的培養液的情況，而且應用這些機械的方法經常會遇到過度的產熱和樣品被氧化等問題。微量細胞裂解的簡化方面的重大進步是以去垢劑為基礎的試劑的發展，如 frPer(Chuetal.，1998) 和 BUgBUSter(GrabSkietaL，1999)。這些試劑的使用不需要昂貴的設備，并且作用非常快速和便于使用。是非常方便有效的髙通量的制備細胞提取物的方法。高活性的酶和酶的混合試劑已經被用來提髙裂解效率和降低提取物的由于消化不完全的基因組 DNA 所導致的高黏度。單獨使用或聯合使用這些商業上可獲得的裂解試劑和酶 (表 18.1) 能夠有效地裂解細菌、酵母、植物、昆蟲和高等真核生物的細胞，并從中提取蛋白質。以去垢劑為基礎的從真核細胞和組織中獲取提取物和蛋白質富集物以及亞細胞組織、細胞器的方法由 Michelsen 和 vonHagen 在本書的第 19 章中詳細介紹。
 化學法裂解細胞的另外一個方面的進步是在高通量自動化處理樣品方面的應用。改進后的試劑和方法可以不收集細胞，直接從大腸桿菌培養液中提取重組蛋白。（Grabskietal.，2001;2003;StevensandKobs,2004)。傳統的蛋白質純化方法首先需要收集細胞，這一步驟為濃縮細胞并去除其中殘余的培養基成分（Burgess，1987;Deutscher，1990;Scopes，1994)。該步驟與一些機械法裂解細胞步驟一樣難以自動化和按比例縮小并同時進行多個蛋白質的小量提取。濃縮后的去垢劑為基礎的試劑（表 18.1), 如 PopCulture、FaStBreakTMffiB~PER 能夠直接與高活性的溶菌酶、核酸酶聯合應用，從而克服這些生物工藝上的障礙，實現自動化。高通量的提取和純化試劑的優勢在于不需要多次離心以從培養基中分離細胞和澄清粗提取物，也不需要機械裂解 (Nguyenetal.,2004)。這些創新允許從全部培養基提取物中親和吸附目標蛋白質，使得細胞培養、蛋白質提取和純化能夠在一個試管中全部完成。 一些細菌裂解試劑中的活性成分是非離子去污劑或兼性離子去污劑（zwitterionicdetergent), 這些試劑的功能是裂解細胞膜和細胞壁結構，削弱細胞的結構以便于通過滲透沖擊、凍融、噬菌體溶菌酶或雞卵白溶菌酶的酶解裂解細胞。除了極少數個例以外，革蘭氏陽性菌通過溶菌酶單獨處理就能夠輕易裂解 (CullandMcHenry,1990)。革蘭氏陰性菌很難僅通過溶菌酶單獨作用裂解，因為其外側磷脂雙分子層 (lipidbilayer) 必須首先經過可滲透化處理 (permeabilize) 以暴露出其肽聚糖，細胞壁才能被酶降解。Tris 緩沖液中添加的 EDTA 能夠使雙分子層中大約 50% 的多聚陰離子脂多糖 (polyanionicIipopolysaccharide) 暴露出來 (Lieve，1974)。但是 EDTA 會干擾固定化金屬親和層析 (immo bilizedmetalaffinitychromatography，IMAC)，而后者是重組蛋白下游純化中最常用到的步驟。去垢劑型裂解試劑對細胞外膜滲透化處理非常有效，而且不會對 IMAC 產生干擾。然而去垢劑為基礎的細胞裂解試劑有幾個缺點，一些用去垢劑提取的蛋白質的溶解性可能會由于去垢劑與蛋白質的相互作用而得到提高。這些蛋白質溶解性高低取決于去垢劑與蛋白質的比例。用這些去垢劑提取一些特定蛋白質的溶解性可能會與以放大的機械性方法提取的蛋白質的溶解性不符。去垢劑和去垢劑中的雜質會干擾下游純化過程和最終的結構鑒定 (Swidereketal.，1997)，而且應該避免使用基于疏水作用的層析分離方法 (Marshaketal.，1996)。盡管存在這些缺點，以去垢劑為基礎的裂解試劑仍然廣泛地應用于現代的基因組學之中。需要被裂解的細胞的結構決定了工作中所需的去垢劑的化學性質和濃度, 在這些裂解試劑中的去垢劑確切的類型和濃度均已被ZL保護。本章所提到的幾篇文獻（Neugebauer,1990;ChuandMallia，2001;EshaghietaL，2005;Kashino,2003) 在蛋白質提取和増溶方面提供了很有價值的信息，按照配方合理地配制提取試劑便可很方便地完成相關操作。 酵母比細菌更加難以裂解。它們致密而復雜的細胞壁占細胞干重的 25%。典型的成分是通過共價鍵、二硫鍵、氫鍵和疏水作用力相互交聯的葡聚糖類、纖維素、甘露糖蛋白和殼多糖。為了較為高效地裂解細胞, 酵母菌應該在對數生長晚期和穩定生長早期收集，因為進入穩定生長期時間越長的酵母菌的細胞壁越厚，而且出芽酵母菌 (buddingyeast) 的細胞壁上也會出現密集的芽痕 (buddingscar) 或芽體 (aggregate)。應該在裂解緩沖液或商業化的裂解試劑之中添加蛋白酶抑制劑, 也可以采用蛋白酶缺陷的菌株來表達蛋白質。還可以采用如 Y-Per 和 YeastBuster(表 18.1) 這樣的試劑來裂解酵母菌。通過控制操作那些在細胞壁合成 (biogenesis) 過程中起作用的基因來裂解酵母的新方法是以前已經成熟的機械法和酶法裂解酵母的補充 (Drottetal.,2002)。 相比較機械法和化學法而言，酶法處理微生物細胞使之裂解并降低裂解物的黏度有幾個顯著的優點: 水解酶對目標細胞的細胞壁成分具有高度特異性, 它們作用溫和，不產生剪切力; 不會導致高溫或氧化等作用的破壞; 操作過程中不需要特殊的專用器械。酶法處理細胞、提取蛋白質可以與機械裂解法相結合來提高目標蛋白質釋放的選擇性，提高提取物的產量和獲取速率，減小對產品的損傷，降低黏度以利于下游操作（Andrewsand 八祀拉〇，1987;0 炫匕 31^&1&1.，1999)。改良的生物工程酶類和酶制劑 (表 18.1) 包括具有高度特異活性的噬菌體溶菌酶，如 rLysozyme、Ready-Lyse; 重組的溶菌酶和非特異性的核酸酶，如 Benzonase 和 OmniCleave; 溶菌酶-核酸酶混合劑（cocktails)，如 Liquisonic、Lysonase 和 EasyLyse，重組的溶菌酶 Ready-Lyse 和 rLysozyme 樓菌體裂解酶具有高特異的比雞卵白溶菌酶高出 200 多倍的活性。淺色鋸桿菌 (Serraiiamarc-esem) 的核酸酶，可用的有高純度的重組酶 Benzonase，是已知的最無特異性的 (promiscuous) 核酸酶。這種酶能夠消化所有形式的 DNA 和 RNA(Meissetal.，1995;NestleandRoberts，1969)。相比較牛胰脫氧核糖核酸酶 KbovinepancreaticDNaseI) 而言，Benzonase 更加平等地攻擊各種底物，這使其對于降低由于 DNA 所導致的提取物的黏度方面具有出色的選擇性。Zymolase 和葡聚糖酶類溶細胞酶 (lyticaseglucanase) 是對于酵母菌細胞裂解及酵母原生質體的獲得方面非常有用的酶類。 酶法處理的潛在問題限制了其應用，特別是在工業化規模的細胞裂解方面。這一問題包括添加的水解酶本身及酶制劑中所含的其他成分使下游的純化變得復雜化；回收產物在裂解時發生降解; 水解酶的最適溫度、pH 可能與目標產物不相兼容等。大多數水解酶在應用上的限制性和昂貴的價格妨礙了它們在工業規模上的應用 (Hopkins，1991)。 二、機械法裂解細胞超聲和高壓裂解已經被高效地應用于微生物、植物和動物細胞的裂解。這些方法已經采用了幾十年，其設備和原理已經被詳細闡明（Harrison,1991;Hopkins，1991;Mid-delberg，1995)。超聲裂解是通過調諧的探頭或機臂的共鳴（15~25kHz) 所引發的髙頻超聲波振蕩產生的剪切力來工作的。在音速的壓力波作用下，液體中產生微小氣泡并隨后塌陷，該過程所產生的內爆產生具有足夠能量的沖擊波從而使細胞壁裂解，并且剪切核酸使樣品的黏度降低。 髙壓勻漿機 (high-pressurehomogenizer) 和壓力擠出機 (pressureextruder) 是通過使強制加壓后的細胞懸液通過狹窄的孔口閥 (orificevalve) 來工作的。這種閥可能只是一個簡單的限流針孔閥 (restrictingneedlevalve)(如弗氏細胞壓碎器），也可能是更加復雜的帶有組合的閥座和沖擊環的設計 (如在 APVManton-Gaulin 勻漿機中）。裂解的機制是借助于在壓力擠出的噴嘴處的壓差和剪切力來裂解細胞。壓力勻漿機裂解細胞的多種機制已經被提出，包括紊流 (turbulence)、空化 (cavitation)、黏性剪切（viscousshear) 和碰撞 (impingement)(KleinigandMiddelberg，1998;Pandolfe，1999)。普遍認為在破碎過程中并不存在完全單一的作用機制。然而，空化和碰撞被認為是細胞裂解的主要作用因素（Shirgaonkaretal」1998;SPXCorp.，2009)。 用玻璃珠研磨懸液中的細胞來裂解細胞是在實驗室規模和生產規模下都比較常用的操作步驟，如上文所提到的玻璃珠研磨機法（球磨機法，beadmilling) 和玻璃珠勻漿法 (beadhomogenization), 玻璃珠研磨機法可以在實驗室內利用簡單的像電磁攪拌器、渦旋混合器或攪拌器來進行操作，也可以采用市售的專用的高速研磨機、振蕩器和攪拌器來完成。細胞裂解程度與細胞濃度、珠子的直徑和材料、珠子在懸液中所占的比例、處理時間和所受到的作用力相關 (Ramananetal.，2008)。這種方法對于一些很難裂解的細胞，如酵母菌、孢子、微藻類 (microalgae) 效率很高，已經成功應用于細菌、植物、動物細胞的裂解，也在大規模真菌的裂解中被優先采用 (Hopkins，1991)。已經有人對球磨機方法的過程和原理進行了綜述 (Harrison,1991;Middelberg,1995)。一般來說，細胞通過與研磨劑及反應池本身相接觸被擠壓，研磨、產生的剪切力使細胞被裂解。 機械法裂解細胞技術所需的專用機器經歷了功能上的革新，出現了很多新的設備。 大多數機械法不易于應用在 5 mL 或更少的培養基所回收的細胞的處理，而且過度的產熱和氧化作用也是機械法裂解細胞所常見的問題。雖然在某些案例中，純化過程中所殘留的去垢劑可能會對蛋白質的生物化學性質或晶體學性質產生干擾，但是 96 孔板和其他型號微孔板專用的多頭超聲探頭（96-wellsonicatorheadandmicroplatehorn) 已經得到了應用（Misonix，Inc.Farmingdale，NY;www.misonix.com)。這種物理的高通量的細胞裂解方法是行之有效的。SonicMan 高通量超聲系統（MatriCal，Inc.Spokane，WA;www.matrical.com) 是分為％ 孔、兇 4 孔或 1536 孔的單獨或組合的系統單元。該系統采用觸屏控制，并采用了一次性墊圈銷蓋 (disposablegasketedpinlid) 來防止孔和孔之間的交叉污染，還有微孔板滑道可以使其直接進入到自動操作站內。其他新的超聲儀，如 BioSpec 的產品是無線的手持 Sonozap 超聲波勻漿機。1/8 英寸直徑的自動調諧探頭應用在 0.3~5 mL 小量樣品上是很理想的。PressureBioscience(www.pressurebiosciences.com) 公司研究出了臺式（benchtop) 的 Barocycler、手持的 PCTShredder 樣品制備系統。這些設備能夠在專用的 PULSE 管中形成快速、高壓力 (最高可達 35kpsi) 環流。這種 1.2~I.5 mL 的管內帶有沖壓的 (ram) 有孔的圓盤 (lysisdisk)，這些圓盤使流體產生很高的壓力，從而很容易就能裂解植物、動物、昆蟲和微生物的細胞（Garrettetal_，2002)。FastPrep(快速核酸提取儀）（MPBiomedicals，Irvine，CA;www.mpbio,com)、Geno/Grinder(SPEXCertiprep，Inc.，Metuchen，NJ;www.spexcsp.com)、Mag-NALyser(RocheDiagnostics，Penzberg,Germanywww.roche.com)、Mikro-Dismem-brator(SartoriusStedimBiotech,Aubagne,France；www.sartorius-stedim.com)^MiniBeadBeaterCBioSpecProducts,Bartlesville,OK；http：//www.biospec.com)RetschMixerMill(RetschGmbH,Haan,Germany;www.retsch.com) 等產品包含了處理幾毫升體積樣品的所有類型的球磨機。這些設備不具有真正意義上的高通量，但是能夠高效地處理 1~5 mL 體系中的極不易裂解 (recalcitrant) 的細胞。 微流體勻裝機（microfluidicsmicrofluidizer)(Newton,MA;www.microfluidicscorp.com) 不同于其他類型的高壓勻漿機。這種設備通過氣壓泵作用使細胞懸液通過固定幾何形狀的微孔道，從而使之加壓、加速及分流。之后當離開裝置出口時兩股高速運動的流體直接相互碰撞產生高剪切力和壓差以裂解細胞。微流體勻漿機型號從適合實驗室用的能夠處理 25 mL 小量樣品的 M-110P，到生物制藥工業規模的、處理量達到 900L/h, 具有完整的過程控制監控器，支持 CIP 的 M-700, 這一系統已經在 21CFR 和環鳥苷酸 (cGMP) 等產品上得到了驗證。ConstantSystemsLtd.(LowMarchDaventry，Northants，England;www.constantsystems.com) 設計了液壓傳動的裂解設備，這種設備的功能類似于原始的弗氏細胞壓碎器，通過施加歧化力（disruptiveforce) 使物料在壓力作用下擠出，但不同的是其參數可調，裂解過程可以控制, 并且具有很好的重現性。ConstantSystems 的設備系列從單次上樣（每次 1~20 mL) 工作臺到連續處理 (405~565 mL/min) 模式均可提供，包括觸屏監測和控制、冷卻夾套和在位清洗/在位滅菌 (CIP/SIP) 等功能。Avestin，Inc.(www.avestin.com) 提供的 EmulsiFlex 高壓勻漿機處理量為 I.0~ 1000L/h。這種勻漿機采用氣栗或電動活塞泵, 產生的裂解壓力為 500~30000psi。這些設備都配有為細胞提取物降溫的熱交換設備，并且能夠進行 SIP 在位滅菌以符合生產企業的藥品生產質量管理規范 (GMP) 要求。Glas-Col，LLC(TerreHaute，IN;www. glascol.com) 公司的 BioNeb 細胞裂解系統采用 10~250psi 的壓力進行氣壓噴霧以裂解 (breakopen) 細胞, 這種方法的好處是不會產熱。霧化孔道里的層流產生使細胞裂解的剪切力，這種力的大小與所采用的壓力、氣體的類型 (氬氣<氮氣<氦氣) 和流體的黏度等因素相關。霧化后的液滴越小，物料黏度越高，采用的氣壓越高，所產生的剪切力越大 (Surzyckietal.,1996)。 三、結束語如果能夠根據細胞的類型和規模進行適當的調整，本章中所介紹的細胞裂解的方式、試劑和設備都是可用且高效的。但一定有人會問: 在具體的某一項應用中，哪種方法才是最佳的？針對這個問題，已經有人對細胞的裂解方式與所得到的提取物中的蛋白質含量之間的關系進行了研究 (BenovandAl-Ibraheem，2002;DeMeyetal.，2008;Guerlavaetal.，1998;HoetaL，2008)。高壓勻漿機和球磨機等物理方法對于大規模的裂解來說是最佳的方法，因為這類方法效率高、成本低，能夠快速地對不同體積的物料進行處理。 超聲法、化學試劑法 (包括去垢劑、酶法處理)、凍融法及酶法與化學法或物理法相結合的裂解方法也是非常高效的，在實驗室里經常用到，尤其是小體積情況下。每種蛋白質的獨特性和不同的宿主細胞結構的差別，使細胞裂解和提取物制備技術的選擇及優化很大程度上是依賴于經驗的。然而，總是可以找到能夠成功地提取和制備生物制品的工具及方法，并且這些方法總是與現代的結構和功能蛋白質組學的需求同步發展的。 四、細胞裂解的流程、試劑和技巧下文所述的以細胞提取物的產品質量為出發點的各種策略和指導方針適用于大多數下游純化及分析過程。盡管介紹的重點是在小規模或較大的實驗室規模的大腸桿菌裂解上，但是一些技術還是可以用于其他來源的細胞裂解和細胞內蛋白質提取，并且是可以放大的。廣泛的蛋白質純化方面的文獻為這里列出的一些蛋白質提取物制備方針及蛋白質純化和鑒定提供了補充信息 (Burgess,1987;Deutscher,1990;HarrisandAngal，1989;Hopkins，1991;Marshaketal.，1996;Scopes，1994)。 緩沖液成分細胞裂解緩沖液的成分和體積不僅對細胞的有效裂解至關重要，而且還將影響隨后的純化過程及目標蛋白質從細胞中釋放出來后的穩定性和回收率。每種提取的蛋白質都是獨特的，理論上應該有一種與其自身的生化性質和預期的純化流程都相適應的提取及純化的緩沖液存在。在大多數的案例中，如果幾個基本條件符合了, 多數的普通提取緩沖液都能取得很好的結果。這些基本條件包括 pH、離子強度、防止降解和改善穩定性的添加劑、緩沖液與細胞的比例等。一個對于通過緩沖液成分和其他方法保持酶活性的非常好的參考資料是 Scopes(1994) 的蛋白質純化 (ProteinPurification)。pH 和緩沖液的技術信息都能夠通過 Dawson 等 (1986) 找到，其中包括制備 pH1~13 的緩沖液的表格、緩沖液性質和鹽的影響、溫度、稀釋度。 提取緩沖液的 pH 選擇應該在蛋白質等電點之上或之下至少一個單位。這種不同于 Pl 的 pH 能夠通過保持蛋白質表面的正電荷或負電荷來防止等電沉淀，還有利于離子交換作為純化的一個步驟。為了保持緩沖能力和最小電導率的增加，緩沖液的離子強度應該為 20~50 mmol/L，所采用緩沖鹽類的 pKa 在所采用的 pH0.5 單位以內。典型細胞細胞質的離子強度為 150~200 mmol/L，這其中含有很高濃度的與離子化蛋白質相互作用的帶電荷的生物活性分子。裂解緩沖液至少應含有 50~100_ol/L 的 NaCl。提高裂解緩沖液的離子強度將會降低這些離子的相互作用力，并且減少帶電粒子的沉淀。這些沉淀會吸附蛋白質，雖可以通過離心或過濾的步驟去除但因此會造成目標蛋白質的損失。最后，緩沖液中應添加可以防止蛋白質降解、提高蛋白質穩定性的物質作為必需的成分。這包括蛋白酶抑制劑 (表 18.2)、還原劑 [如二硫蘇糖醇 (dithiothreitol，DTT)]、磷酸三 (P-氯乙基）醋 [tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP]、三（3-輕基丙基）膦 [tris(hydroxyprophl)phosphine，THP]、二價陽離子、輔因子、kosmotropes(如甘油、山梨醇或海藻糖)。水溶的無氣味磷化氫類的 TCEP 和 THP 都非常穩定，并且比大多數通常使用的硫氫基還原劑/9■巰基乙醇 (浐 mercaptoethanol) 和 DTT 等對保持還原狀態的二硫鍵更加有效 (Clineetal.，2004;Getzetal.，1999;HanandHan,1994)。可以添加非離子的和兩性的去垢劑以增加疏水性蛋白質的溶解度。還原劑、蛋白酶抑制劑和去垢劑會干擾一些純化過程及檢驗檢測分析方法的結果。在選用緩沖液中所采用的化學制劑和其濃度時，這些成分的潛在干擾必須要考慮。對于大腸桿菌細胞裂解所采用的萬金油緩沖液 B(bufferB) 為:50 mmol/LTris-HCl 或者是憐酸鈉 pH7.5~8,0、50 mmol/L NaCl、5% 甘油、0.5 mmol/LEDTA 和 0.5 mmol/LDTT。推薦采用酵母的裂解緩沖液 (bufferY) 和昆蟲細胞的裂解緩沖液 (bufferI) 的配方在下文中會給出。
為了有效地裂解菌體，并保證通過離心和過濾去除不溶的細胞組分沉淀物質后的提取液的回收效率，用來重懸細胞的緩沖液的體積至少要達到原始細胞體積的 3 倍以上。 因為不溶物會吸附約自身體積 50% 的液體，所以至少采用 3 倍體積的緩沖液才能保證最高 85% 的液體回收率。蛋白質在髙濃度下更加穩定，但是高濃度的提取液難以操作，并且會發生蛋白質聚集。盡管裂解緩沖液與細胞體積的比例為 3:1 可以得到濃度更高的提取液, 但是 5~10 倍體積的緩沖液是更加優先選擇的，而且能夠得到更多的可溶性的蛋白質和更低的提取物黏度。 細胞裂解緩沖液注意: 在這些緩沖液中，蛋白酶抑制劑可以添加也可以被省略 (表 18.2)，這要看目標蛋白質對蛋白酶水解的敏感性，以及所需要的抑制劑的量和種類。如果起始的蛋白質分離步驟是離子交換色譜法，那么緩沖液 I 和緩沖液 Y 的離子強度可以降低或者提取完畢后再進行稀釋。 小規模大腸桿菌細胞裂解規程1.去垢劑為基礎的裂解試劑10 mL 裂解試劑溶液的配方：10 mLB-Per 或 BugBuster,20/iLLysonaseBioprocessingReagent。如果需要減少蛋白質水解和增加目標蛋白質可溶性及穩定性可以添加，如 EDTA、蛋白酶抑制劑、5%~10% 甘油和還原劑等添加劑。選擇緩沖液的成分及其濃度時要考慮到隨后的純化和檢測的需要。 (1) 將 ImL 培養基加入 2 mLX96 孔板中, 或者將 5 mL 培養基加入 24 深孔的平板中，并用透氣的封口膜或 BugStopperTM 封口帽 (capmat) 封口以培養菌體和表達目標蛋白質。 (2) 離心收集菌體。 (3) 吸出并棄去培養基。 (4) 用移液器重懸菌體于 100~200yL 裂解緩沖液中。 (5) 混合并在搖床上振蕩 10 min 以進行反應。 (6) 吸取 10 混合液以進行全菌體裂解物分析。 (7) 離心 5 min 后取出 10 上清液以分析可溶性蛋白質。剩余的上清液則可用于其他分離或分析操作。 (8) 出現在不溶組分中的目標蛋白質的量可以通過比較第（6) 步的全部菌體提取物和第 (7) 步中的可溶性蛋白質之間的差別來間接估計。典型的樣品比較方法是電泳、酶聯免疫吸附實驗 (ELISA) 或酶學分析。不溶組分的直接檢測可通過吸出可溶性的上清液后，將剩余的沉淀部分溶于 SD^PAGE 上樣緩沖液中之后進行電泳的方式得出。 注意: 制備 SDS^PAGE 的蛋白質樣品的程序和技巧在 Grabski 和 Burgess(2001) 中可以得到。這篇文章提供了 SD&PAGE 樣品緩沖液的配方、蛋白質樣品制備、凝膠上樣建議，并且給出了分析難以分析的樣品的替代方法。 2.去垢劑為基礎的全培養物細胞裂解試劑10 mL 裂解試劑的配方：10 mLPopCulture、FastBreak 或 B-PerDirect,200yLLysonaseBioprocessingReagent。隨后的規程能夠在多孔板利用自動液壓傳動平臺來完成，在一塊平板上可以采用多通道移液器來對多種培養物同時進行操作。用于將親和樹脂從培養物提取物和經過處理的溶液中分離的多孔過濾板能夠從多個制造商獲得。利用專門的磁性針板 (magneticpinplate) 或者平臺來分離磁珠已獲得成功。 (1) 在 2 mLX96 孔的板中加入 ImL 或者在 10 mLX24 深孔的平板內加入 5 mL 培養基培養細胞并表達目標蛋白質，并用透氣的封口膜或者 BugStopperTM 封口帽封口。 (2) 添加 1/10 培養基體積的裂解試劑。 (3) 用移液器混合，并在搖床上振蕩 10miri 以使反應充分進行。 (4) 取出 50yL 全細胞裂解液混合物以用于分析。樣品可采用電泳、ELISA 或酶法分析。直接的 SD^PAGE 分析和考馬斯亮藍染色分析需要髙表達水平和很大的樣品上樣量或通過沉淀的方法來檢測被稀釋的蛋白質樣品。用特別的濾板 (Pall,Millipore,3M) 能夠從蛋白質溶液中去除蛋白質聚集體和包涵體，從而在這一步能夠很容易的檢測蛋白質的可溶性表達水平。 (5) 直接將平衡好的親和捕獲樹脂 (affinitycaptureresin) 或親和磁珠加入到未經處理的細胞裂解物中。典型的加量為 50~100 ML 凝膠漿 (在捕獲緩沖液中含有 50% 的凝膠漿 VmL 起始培養基體積，根據凝膠對重組蛋白的捕獲能力和目標蛋白質的表達水平來決定具體添加量。 (6) 用 10~30 倍凝膠體積的漂洗緩沖液來清除雜質。 (7) 用 3 倍體積的洗脫緩沖液洗脫目標蛋白質。 3.凍融法加酶法裂解10 mL 裂解試劑的配方:10niL 濃度為 50~100_ol/L 的裂解緩沖液 (采用甘氨酸、乙酸鈉、Tris-HCK 磷酸鈉或 HEPES 中的某一種取決于所期望使用的 PH)，50~ 300mrnol/LNaCl，30jixLLysonaseBioprocessingReagent。例如，EDTA、去垢劑、蛋白酶抑制劑、5%~10% 甘油和還原劑等可以按需要添加到裂解緩沖液中用于減少目標蛋白質的水解, 增加其溶解性和穩定性。當選擇裂解緩沖液成分及其濃度時要考慮到下游的純化及分析過程的要求。 凍融法裂解細胞的效率取決于細胞懸液的密度、凍融的循環數、冰凍的速率。但是實驗表明，其對于大腸桿菌中的蛋白質釋放的效率低于球珠渦旋法 (beadvortexing)、弗氏壓碎器或超聲 (BenovandAl-Ibraheem，2002)。然而，當結合溶菌酶裂解時，對于不穩定蛋白質來說其是一種溫和的釋放方法，并且不需要特殊的裝置。緩慢的凍融循環破裂細胞膜，將細胞壁暴露使之與酶接觸并被降解。 (1) 將 ImL 培養基放在 2 mLX96 孔板中，或者將 5 mL 培養基放在 10 mLX24 深孔的平板中，并用透氣的封口膜或 BugStcwerTM 封口帽封口以培養細胞并表達目標蛋白質。 (2) 離心使菌體形成沉淀。 (3) 吸出并棄去殘余培養基。 (4) 將菌體置于_20°C 至完全冰凍。 (5) 用移液器加人 100~200 裂解試劑并重懸菌體。 (6) 將之置于搖床上室溫振蕩反應 10 min。 (7) 再次將懸液重新置于一 20°C 至完全凍結。 (8) 室溫溶解, 混勻，并取出 10fxL 全細胞裂解混合物以備分析。 (9) 離心 5 min, 取出 10juL 上清液以分析可溶性蛋白質，剩余的已經澄清的上清液則可用于其他純化或檢測過程。『’ (10) 不溶組分中目標蛋白質的量可以通過比較第（8) 步獲得的全細胞裂解液和第 (9) 步獲得的可溶性蛋白質樣品之間的差別間接分析得出。典型的比較分析方法是電泳、ELISA 或酶法。不溶組分的直接分析可以通過吸出上清液后，將沉淀部分溶于 SDSPAGE 上樣緩沖液中，并 SD^PAGE 分析得出。 克級規模大腸桿菌機械裂解1.超聲以下所述超聲流程適用于 2~50 g 菌體的裂解。 (1) 用已稱重去皮的離心桶或離心管 9000 g 離心 15 min 以收集菌體。 (2) 傾出并棄去培養基，將離心桶倒置在紙巾上以去除殘余的培養基，記錄菌體濕重。 (3) 將菌體置于一 20°C 完全凍結, 并于一周內處理以獲得最佳的結果。長期儲存菌體應置于一 80°C 以使蛋白酶水解最小化。新鮮的未凍結的菌體也可以使用，但是由于細胞膜還很完整，使得用溶菌酶對菌體進行預處理的效率很低。 (4) 用手持勻漿機在低轉速情況下將菌體按照 7~10 mL/g 的比例完全重懸于 4°C 的裂解緩沖液中，避免劇烈的攪拌產生氣泡以防止氧化作用。 (5) 可選擇的：加雞蛋中提取的溶菌酶 (0.2 mg/mL) 或重組的溶菌酶（60KU 或 0.2pL/mL) 并添加核酸酶，如 DNaseClOpg/mL) 或 Benzonase(l.0pL/mL)。 (6) 將懸浮液置于玻璃燒杯內，并置于冰上超聲 60~90s。通過調整機器設定、探針插入深度和超聲持續時間防止過熱和打空。注意: 操作時不能使超聲探頭接觸到玻璃燒杯，以防止玻璃破裂。對于 100 mL 菌體懸液來說，用 BransonModelS-450sonifier(BransonSonicPowerCo.，Danbury，CT;www.bransonultrasonics.com) 采用 1/2 英寸直徑的探頭, 設定 4 組超聲，每組 8 次，占空比為 70%，通常就能達到裂解效果。每次超聲間隔幾分鐘, 并置于冰上攪拌。如果需要，在此處取出 5(VL 樣品 (在離心之前) 用于分析全菌體的蛋白質。 (7)4°C、15000 g■離心 15 min, 將上清液轉移到另一個容器中，小心操作，不要攪動菌體沉淀。依照下一個分離步驟對顆粒的耐受情況，可溶的組分可以通過低蛋白質吸附的濾器過濾進一步澄清。如果采用注射器式濾器 (syringefilter) 進行澄清，可以以串聯的方式在上面放置 0.8yin 濾膜，下面放置 0.45 濾膜。大孔徑的濾器在流路中首先防止小孔徑尺寸濾器處的污垢沉積過快。最終澄清的上清液含有菌體蛋白質的可溶的組分，并且可以直接進行色譜層析或其他下游的分離或分析操作。 2.高壓勻漿下面所介紹的批量化的高壓勻漿操作適用于采用 APVGaulin 勻漿機（APVFluidHandling,Delevan,WI;www.apv.com)、Microfluidizer 或 ConstantSystem 的液壓破碎儀處理濕重為 50~500 g 菌體的操作。高于 500 g 菌體的裂解應該采用多批次的處理方法，或采用之前所提到的連續的菌體裂解設備。 (1) 接著上面所說的超聲處理方法的第 (3) 步和第⑷步的方式重懸新鮮或冰凍的菌體，如果采用瓦林式（Waring) 或小型混合器（WaringProducts，Torrington,CT;WWW.waringproducts.com)，則注意需要低速重懸菌體，不要過度攪拌并且在全程保持提取物處于冷卻狀態。算上裂解之后漂洗裂解設備的緩沖液，重懸的體積應該少于 10 mL/g 的比例。混合之前，從已經計算好的重懸體積中取出 50~100 mL 的裂解緩沖液放在一邊備用。這些緩沖液將用來在樣品處理之后沖洗設備。用這些緩沖液沖洗可以將設備死體積中的殘余提取物沖出。 (2) 如果采用 Gaulin 細胞裂解器，在裂解大腸桿菌時，在 10000psi 壓力下處理兩次。當處理難以裂解的菌體，如酵母菌，可能需要更多的處理次數或持續循環處理。如果采用的是 Microfluidizer 或液壓式的細胞勻漿機，則按照廠商的操作說明進行操作。在處理過程中，特別是小體積的操作時, 樣品會發生非常明顯的產熱現象。在處理過程中，通過將收集管路浸入到干冰乙醇浴 (dryiceethanolbath) 中將裂解液冷卻到 5~10°C。通過持續攪拌和定時將管路從冷浴 (coolingbath) 中移出來減少裂解液在收集管底部和邊上的凍結。 (3)4°C、15000 g 離心 30 min 裂解液。傾倒出上清液并用 Miracloth(EMDBiosciences-Calbiochem，Gibbstown,NJ;www.emdbiosciences.com) 將之過濾到另一個容器中，小心不要攪動沉淀。可溶組分按照隨后的分離步驟對顆粒的忍耐度可以用較小孔徑的低蛋白質吸附的濾器進行進一步澄清。最終澄清的上清液中含有菌體蛋白質的可溶組分，并且可以用于進行色譜層析或其他下游的分離或分析操作。 展開 | 