3 甲基化干擾實驗
用來檢測蛋白質的結合位點。甲基化修飾的DNA探針可以干擾蛋白質的結合。結合位點上未被修飾的DNA片段才能與蛋白結合,然后將DNA從被修飾的堿基處切割,電泳分離,結合蛋白的DNA在結合位點上不能被修飾,不能切斷,可確定結合位點的位置。
4 Dnase I 足紋分析
蛋白質精確結合位點的研究方法。Dnase I 可以切割DNA中磷酸二酯鍵,而結合蛋白質的DNA免于Dnase I水解,不能被切割。
方法:選擇性末端標記DNA片段,加入蛋白質形成復合物,后加入Dnase I ,形成1個堿基的梯度,而蛋白質結合部位,留下空白。
5 隨機PCR
隨機PCR可以模擬體內DNA-蛋白質相互作用機制。動態地觀察DNA-蛋白質的結合情況。
隨機PCR試驗的步驟
1)合成寡核苷酸:隨機序列區域
2)標記核酸成探針
3)進行多次凝膠滯后實驗
4)確定特異性探針后,進行克隆和測序,統計隨機序列區域各堿基出現的數量,
動態確定蛋白質結合部位。
6 核酸-蛋白質雜交
southwestern雜交。鑒定蛋白質與DNA特異性結合,確定結合蛋白質的分子量
7.蛋白質-核酸紫外交聯法
DNA-蛋白質復合物經紫外線照射后,導致交聯。交聯的部位在DNA的嘧啶堿基和蛋白質的多種氨基酸的側鏈基團。
紫外交聯使DNA上的標記轉移到蛋白質上,進而可利用SDS-PAGE測定其分子量。
七、蛋白質組及其質點的分離與分析
1 二維電泳(2-DE)
目前最有效的蛋白質分離技術。它包括等電聚焦凝膠電泳和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。前者根據電荷的差異,后者根據分子量不同將各種蛋白質和成分分離。
維電泳的原理
1)等電聚焦電泳:
兩性電解質含有脂肪族多氨基多羧酸,在電場中形成穩定的PH梯度,當蛋白質電泳到其等電點處,凈電荷為0,停留在此位置,進而將蛋白質分離開。現建立一種新的
IEF,使用固相PH梯度等電聚焦(IPG-IEF),它的分辨率比傳統IEF具有更高分辨率,分辨率可以達到0.001pH。
2)SDS-PAGE
SDS:十二烷基硫酸鈉是一種去污劑,從而使蛋白質獲得負電荷,因此屏蔽蛋白質,因此電泳遷移率僅與分子大小相關。
2-DE步驟:樣品制備、蛋白質的溶解、變性、還原以及去除、蛋白質雜質,IPG膠制備、雙向電泳、蛋白質的染色
蛋白質染色:
1)考馬斯亮藍染色:蛋白質常用的染色方法,靈敏度比銀染低,但利于蛋白質的圖譜分析。
2)銀染色:是一種靈敏度高、分辨率好、應用廣泛的方法。缺點是銀染條帶與蛋白質量不成比例,不便于蛋白質圖譜分析。銀染時常常造成蛋白質末端封閉,不能進行序列分析。
2.蛋白質芯片技術:
將蛋白質固定在硅物質表面,通過大分子之間的特異性識別和結合進行檢測.
3.質譜分析技術
原理:將樣品離子化,根據不同的質量和電荷差異確定分子量的技術。
應用:1)蛋白質序列分析:質譜形成的肽離子為母離子,與惰性氣體碰撞,使肽鏈中肽健斷裂,性成一系列碎片,進行序列分析;2) 蛋白質修飾分析
八、 蛋白質分子結構分析:
測定溶液中蛋白質結構:核磁共振、圓二色譜法、熒光光譜法等測定晶體蛋白質結構:X射線衍射分析法、小角中子衍射法。
九、蛋白質數據庫
(一)蛋白質序列數據庫
1.SWISS-PROT數據庫:蛋白質序列、文獻、分類等。
http://www.ebi.ac.uk/swissprot
2.PIR和PSD數據庫:最大的數據庫
htpp://pir.georgetown.edu
(二)蛋白質結構數據庫
1.蛋白質數據倉庫(PDB):蛋白質分子的三維結構。(X光晶體衍射和核磁共振)
http://www.rcsb.org/pdb
2.蛋白質結構分類數據庫(SCOP):蛋白質之間的關系
http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/
3.PROSITE數據庫:提供蛋白質位點和序列模式
http://www.expasy.ch/proside/
十、蛋白質組學研究:
1 用于疾病診斷的研究
2 發病機制的研究
3 致病菌耐藥性研究