實驗概要
本實驗介紹了Western雜交的基本流程。
主要試劑
液氮，提取緩沖液(1 x PBS，10ug/mL Leupeptin，1 mM PMSF，5 mMBenzamidine. 2mM EDTA)，轉移緩沖液(39mM Glycine，48mM Tris，0.037% SDS，20%甲醇)，PBST (1 x PBS，0.1% Tween20)，封閉液(1 x PBST，5% skim milk)，雜交緩沖液(1 x PBST，5% skim milk)，一抗，二抗(HRP conjugated)
主要設備
研缽，高速離心機，電泳儀，蛋白電泳槽，PVDF膜，Whatman濾紙，轉膜槽
實驗材料
植物葉片
實驗步驟
1. 蛋白提取
1) 取1-2片植物葉片液氮速凍，研磨成細小粉末。
2) 加入100ul提取緩沖液(1 x PBS，10ug/mL Leupeptin，1 mM PMSF，5 mMBenzamidine. 2mM EDTA)研磨直至均勻。
3) 14000 rpm于4℃離心10分鐘，取上清。
2 . Western雜交
1) 配制成10-15%的SDS-PAGE膠，取10-20ug蛋白電泳。
2) 電泳結束后取下蛋白膠，浸泡于轉移緩沖液(39mM Glycine，48mM Tris，0.037% SDS，20%甲醇)中。
3) 切一張與蛋白膠相同大小的PVDF膜，在膜左上角標記，用甲醇漂洗后浸泡于轉移緩沖液中。
4) 切兩張與蛋白膠相同大小的Whatman濾紙，浸泡于轉移緩沖液中。
5) 按順序先后組裝轉移裝置:負極，濾紙，蛋白膠，PVDF膜，濾紙，正極。
6) 100伏電壓轉移45分鐘。
7) 轉移完成后取下膜用PBST (1 x PBS，0.1% Tween20)洗5分鐘。
8) 將膜置于封閉液(1 x PBST，5% skim milk)中封閉2小時。
9) 用PBST洗膜5分鐘。
10) 加入雜交緩沖液(1 x PBST，5% skim milk)，再加入一抗，室溫孵育2小時。
11) 用PBST洗膜3次，每次5分鐘。
12) 加入雜交緩沖液(1 x PBST，5% skim milk)，再加入二抗(HRP conjugated)室溫孵育30分鐘。
13) 用PBST洗膜3次，每次5分鐘。
14) 用PBS洗膜5分鐘。
15) 用ECL顯色并照相。