肉毒中毒的實驗室診斷，從病人的血清、糞便、嘔吐物及可疑食品等樣本中檢測到毒素是最可靠的診斷依據。在美便、胃腸道物和受傷組織等樣本中檢測或分離到肉毒桿菌，可支持診斷，但不能以此確診。但在一些嬰兒肉毒中毒病例中，只要在糞便或胃腸物中發現肉毒桿菌，即使在樣本中檢測不到肉毒毒素，也有確診意義。
小鼠生物試驗（致死試驗）是國際公認的肉毒毒素檢測金標準方法，也是最靈敏的檢測方法，靈敏度可達1MLD（相當于10pg）.雙抗夾心ELISA是美國SDA和AOACinternational批準的第一個官方認可的肉毒毒素檢測方法，靈敏度可達100pg.在我國針對食品微生物檢驗制定了肉毒桿菌與肉毒毒素的國標GB/T4789.12-2003。該標準主要包括：檢測毒素的小鼠致死試驗以及菌落形態觀察試驗、產毒培養試驗和分離培養試驗等。現行標準的缺點是耗費時間長、需使用實驗動物和各型別肉毒毒素的診斷血清。
肉毒毒素的檢測方法還包括：禽眼瞼閉合試驗、快速免疫層析試驗、肽鏈內切酶ELISA等。禽眼瞼閉合試驗是我國學者建立的一種新的生物試驗法，靈敏度可達1ng。基于金標記的免疫層析法可在5min內出結果，操作簡單，但靈敏度低（10~50ng），適合現場快速篩查。基于肽鏈內切酶ELISA是利用肉毒毒素的內肽酶活性，結合免疫學檢測方法或光譜技術檢測裂解的底物多肽，或者在底物蛋白上作熒光標記，裂解后檢測熒光信號。該方法最大特點是能檢測有活性的毒素，且特異性強、靈敏度高，也可用于毒素分型檢測，值得推廣使用。
肉毒桿菌的核酸檢測方法已非常成熟，如PCR、熒光定量PCR以及多重PCR等檢測A~F型肉毒桿菌的試驗方法均有報道。但還沒有肉毒桿菌核酸檢測的國家標準，僅有A、B、E、F型肉毒桿菌PCR檢測的行業標準（SNT2525-2010）。有必要盡快制定A~G型肉毒桿菌的PCR或熒光定量PCR檢測的國家標準，以滿足食品生產企業的需求。