高效簡化方法讓噬菌體“更小更強大”

　　抗生素曾一度是致病菌的天敵。由于抗生素的濫用，細菌產生耐藥性的速度遠高于新抗生素研發的速度，導致了“超級耐藥菌”的出現，堪稱細菌中的“小強”。

　　噬菌體是一種病毒，這種病毒專門“感染”并殺死細菌。在發現伊始，噬菌體就被用來對抗細菌感染。作為“殺菌利器”，噬菌體只要遇到宿主細菌就會鉆進其體內并進行大量繁殖，從內部裂解細菌，釋放出成百上千的下一代噬菌體，自此循環直到把所有的細菌斬盡殺絕。

　　此前，中國科學院深圳先進技術研究院馬迎飛團隊聯合醫院實現了深圳市首例應用噬菌體治療耐藥鮑曼不動桿菌肺部感染的臨床試驗，展示了噬菌體治療臨床超級耐藥菌的感染方面具有極大的應用價值。那么，將噬菌體應用在臨床中會遇到哪些難題？

　　12月14日，馬迎飛團隊在國際學術期刊《核酸研究》上發表最新研究進展，提出了一種高通量制備底盤噬菌體的方法。該研究解決了在高通量刪除噬菌體冗余基因方面的三大難題，為噬菌體治療和噬菌體合成生物學的研究提供巨大助力。

　　改善“殺菌利器”面臨三大挑戰

　　過去，我國在抗生素上的使用占全球使用量的一半，這使我國人民的身體健康受到超級細菌的威脅。如何對抗耐藥菌成為科學界面臨的巨大難題，而噬菌體合成生物研究為解決這一難題提供了新的思路和方法。

　　面對超級耐藥菌，噬菌體治療是最有效的殺手锏之一。2014年，噬菌體療法被美國國家過敏與傳染病研究所列為應對抗生素抗藥性的重要武器之一。

　　我們能否對這樣的殺手锏進行改進，比如向噬菌體基因組內插入能夠為其增加“殺傷力”的基因，讓噬菌體能夠更加勇往直前且大殺四方。

　　噬菌體通常具有較小的基因組，其中還有很多的“冗余基因”，導致基因組內沒有空余的位置插入“基因武器”。同時，這些“冗余基因”有可能會編碼一些對人體有害的蛋白。對此，研究團隊設想，如果能將噬菌體基因組內的“冗余基因”刪除，得到一個精簡的安全的“底盤噬菌體”，同時獲得足夠的位置插入功能基因。

　　如何實現這一目標，科研團隊面臨三大挑戰：一是如何高通量快速地鑒定和刪除噬菌體的“冗余基因”；二是怎樣同時獲得具有更高殺菌效率的突變噬菌體；三是逐個刪除這些基因需要巨大的工作量。這些挑戰都使得研究團隊在獲取“底盤噬菌體”的路上異常艱難。

　　開發迭代噬菌體基因組簡化系統

　　那么，馬迎飛團隊是如何解決這三大難題的呢？

　　在細菌中，有一種對抗噬菌體的防御系統叫做CRISPR-CAS系統，當噬菌體侵染到含有這一系統的細菌時，噬菌體的基因組會被“切割”。對此，研究人員可以在細菌中通過人工合成的方式設計一套CRISPR-CAS系統，當噬菌體基因組進入含有這一系統的細菌內部時，某個特定的基因將會被刪除。

　　正是基于CRISPR的原理，馬迎飛團隊開發了一種自上而下的全基因組簡化方法，稱為“基于CRISPR-Cas9的迭代噬菌體基因組簡化方法”（CRISPR/Cas9-based iterative phage genome reduction, CiPGr）。

　　團隊結合芯片合成技術針對測試的噬菌體的不同基因構建了大量的CRISPR系統，接下來將含有針對不同噬菌體基因的CRISPR-CAS系統宿主菌混合在一起，并被噬菌體侵染。噬菌體會隨機進入到一個細菌內，被其刪除一個基因。若被刪除的基因無足輕重，那么噬菌體會在細菌內繼續繁殖，釋放出更多子代噬菌體，再進入下一個細菌并被隨機刪除下一個基因。這一過程自發進行，不斷有更多的冗余基因被刪除，最終獲得精簡的、有活性的底盤噬菌體。

　　在CiPGr過程中，研究團隊只需要獲得噬菌體基因組序列，就能夠將該方法輕松推廣至其他野生型噬菌體。這些精簡的噬菌體能夠整合更多的基因元件以增強噬菌體的功能，在噬菌體治療中具有巨大的應用潛力。

　　“該研究也提示，噬菌體基因組中必需、非必要和準必需基因的鑒定對于噬菌體基因組的重新設計和噬菌體生物學的研究具有重大意義。”馬迎飛說。