格里斯試劑比色法測定食品中的發色劑

亞硝酸鹽測定采用鹽酸萘乙二胺法,又稱格里斯試劑比色法。

1. 測定原理

樣品經過沉淀蛋白質、去除脂肪后,在弱酸條件下亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸重氮化,再與鹽酸萘乙二胺偶合形成紫紅色染料,其最大吸收波長為538nm,且色澤深淺在一定范圍內與亞硝酸鹽含量呈正比,可與標準系列比較定量。

2. 試劑

① 亞鐵氰化鉀溶液    稱取106.0g亞鐵氰化鉀[K₄Fe(CN)₆·3H₂O],用水溶解,并稀釋至1000mL。

② 乙酸鋅溶液    稱取220.0g乙酸鋅[Zn(CH₃OO)₂·2H₂O],加30mL冰乙酸溶于水,并稀釋至1000mL。

③ 飽和硼砂溶液    稱取5.0g硼酸鈉(NaB₄O₇·10H₂O),溶于100mL熱水中,冷卻后備用。

④ 對氨基苯磺酸溶液(4g/L)    稱取0.4g對氨基苯磺酸,溶于100mL20%鹽酸中,置棕色瓶中混勻,避光保存。

⑤ 鹽酸萘乙二胺溶液(2g/L)    稱取0.2g鹽酸萘乙二胺溶解于100mL水中,混勻后置棕色瓶中,避光保存。

⑥ 亞硝酸鈉標準溶液(200μg/mL)    準確稱取01000g于硅膠干燥器中干燥24h的亞硝酸鈉,加水溶解后定容到500mL。

⑦ 亞硝酸鈉標準使用液(5.0μg/mL)    臨用前,吸取亞硝酸鈉標準溶液5.00mL,置于200mL容量瓶中,加水稀釋至刻度。

3. 儀器

小型絞肉機;分光光度計。

4. 操作方法

(1)樣品處理    稱取5.0～10.0g粉碎混勻的樣品,置于50mL燒杯中,加12.5mL硼砂飽和液,攪拌均勻,用約300mL70℃左右的熱水將樣品洗入500mL容量瓶中,于沸水浴中加熱15min,冷卻至室溫。邊轉動容量瓶邊加入5mL亞鐵氰化鉀溶液,搖勻,再加入5mL乙酸鋅溶液,以沉淀蛋白質。加水至刻度,搖勻,放置0.5h,除去上層脂肪后過濾,棄去初濾液,濾液備用。

(2)測定    吸取40.0mL上述濾液于50m具塞比色管中,另取0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL亞硝酸鈉標準使用液(5.0μg/mL),分別置于50mL具塞比色管中。于標準管與樣品管中分別加入2mL對氨基苯磺酸溶液(4g/L),混勻,靜置3～5min后各加入1mL鹽酸萘乙二胺溶液(2g/L),加水至刻度,混勻,靜置15min,于波長58nm處測吸光度,并繪制標準曲線。同時做試劑空白實驗。

 5. 結果計算

式中    X——樣品中亞硝酸鹽的含量,mg/kg;

          m——樣品質量,g;

          m^'——測定用樣液中亞硝酸鹽的質量,μg;

          V₁——樣品處理液總體積,mL;

          V₂——測定用樣液體積,mL。

6. 討論

① 本方法為國家標準法GB/T5009.33—2003標準方法,亞硝酸鹽最低檢出限為1mg/kg。

② 亞鐵氰化鉀和乙酸鋅作為蛋白質沉淀劑,使產生的亞鐵氰化鋅沉淀與蛋白質產生共沉淀,蛋白質沉淀劑也可采用硫酸鋅溶液(30%)。

③ 飽和硼砂溶液的作用:亞硝酸鹽提取劑,同時也是蛋白質沉淀劑。

④ 對于含油脂多的樣品,可去提取液中的上層脂肪;對于有色樣品可用氫氧化鋁乳液脫色后再進行顯色反應。

⑤ 本測定用水應為重蒸餾水,以減少誤差。