1.取出實驗所需板條，并記錄各孔位置。
2.在對應的孔中加入標準品、質控及待測樣本各50ul。
3.每孔加入25ul樣本稀釋液A。
4.每孔加入25ul樣本稀釋液B。
5.封板，以300-400rpm速度震蕩，室溫下過夜（14-18小時）。
6.洗板3次，在吸水紙上拍干。
7.每孔加入50ul抗體-生物素結合物。
8.封板，以500-700rpm速度震蕩，室溫下孵育1.5小時。
9.洗板6次，在吸水紙上拍干。
10.每孔加入50ul鏈霉和素-辣根過氧化物酶結合物。
11.封板，以500-700rpm速度震蕩，室溫下孵育20分鐘。
12.洗板6次，洗完最后一次以后，將洗液在孔內停留15分鐘再除去。在吸水紙上拍干。
13.在每孔中加入100ulTMB底物溶液。
14.以500-700rpm速度震蕩，室溫下避光孵育15-30分鐘。
15.每孔加入100ul終止液。
16.30分鐘內在450nm處讀數。
注：必須以零標準作空白。如果能做到雙波長測定，可在600或620nm處讀數，將600（620）nm吸收值從450nm處減去，這樣可以減少光學誤差。
