hERG鉀離子通道高通量安全性篩選（二）

材料和方法

穩定轉染人Kv11.1 通道的中國倉鼠卵巢細胞(CHO)來自ChanTest 公司(Cleveland, OH)。本實驗中所使用的所有試劑和藥品均來自Sigma-Aldrich(St. Louis, MO).

hERG 離子通道多次加樣方法的開發

多次加樣的方法中細胞需要進行多次的溶液交換并且電壓刺激時間延長，從而增加了電流rundown 的可能性。為提高試驗時間加長后細胞記錄的穩定性，使用單次脈沖電壓刺激方案代替原來單次加樣方法中的５次脈沖電壓刺激方案。化合物溶于細胞外液中，濃度為3 倍終濃度，含有1% DMSO。

實驗時加入記錄孔后被稀釋至最終濃度，DMSO 的濃度為0.33% 。化合物加入記錄孔后孵育一分鐘后開始給予電壓刺激，+40 mV 持續一秒，然后再施加-50 mV 刺激一秒，用以檢測尾電流峰值（圖1）。一次實驗需要準備6 個不同濃度梯度的化合物板，便于加樣頭完成6 次加樣。完整的實驗方法確認后，依次檢測選定的7 個hERG 陽性藥物。

化合物溶于細胞外液中，濃度為3 倍終濃度，含有1% DMSO。實驗時加入記錄孔后被稀釋至最終濃度，DMSO 的濃度為0.33% 。化合物加入記錄孔后孵育一分鐘后開始給予電壓刺激，+40 mV 持續一秒，然后再施加-50 mV 刺激一秒，用以檢測尾電流峰值（圖1）。一次實驗需要準備6 個不同濃度梯度的化合物板，便于加樣頭完成6 次加樣。完整的實驗方法確認后，依次檢測選定的7 個hERG 陽性藥物。

多次加樣實驗的記錄穩定性結果見圖2。圖中分別展示了其中一次實驗所有384 孔的平均封接電阻值，以及24 個
對照孔0.33% DMSO 外液6 次加樣后得到的尾電流峰值為基準的平均通道激活程度。

單孔多次加樣方法的藥理學特性：產生的累積濃度效應數據類似于傳統膜片鉗技術方法

在7 個hERG 陽性藥物藥理學驗證實驗中，每次實驗需要連續監測6 塊化合物板。每個化合物板只有每個待檢
測化合物的一個濃度，每個化合物重復24 個孔。第一塊化合物板的濃度最低，第六塊化合物板的濃度最高。

在7 次獨立的實驗中各自得到一個量效曲線和相應的IC50 值。圖3 展示了一個代表性實驗中得到的藥學曲線。

化合物多次添加方法的數據重復性檢測

篩選實驗中數據的穩定性是非常重要的。采用前述已優化好的實驗條件，所有七次陽性hERG 抑制劑的藥理學數據均表現出良好的可重復性。六次化合物添加實驗的穩定性展現在圖4 中。這種穩定性尤其重要，體現在加樣后及施加電壓刺激后的穩定電流記錄的技術要求方面。

其中一個檢測的陽性藥物，哌咪清（Pimozide） ，觀察到其重復性低于預期。這可能與化合物的高親脂性相關，從而造成了化合物在篩選過程中多數的塑料材料環境下的不穩定性。

總結

本次實驗驗證了單孔多次加樣方法在保證數據質量的前提下，可以顯著增加通量且降低運行成本。
? 通量顯著的從 1100增加至4600個數據點每小時。
? 藥理學結果方面，單次加樣和多次加樣的IC50值保持很好一致性。
? 整個實驗結果保持穩定性和重現性
? 累積濃度效應數據類似于傳統膜片鉗技術方法

參考文獻

Application protocol: “Validation of the IonWorks Barracuda System for hERG Ion Channel Assay”, by Karen Cook, M.S., James L. Costantin, Ph.D., and Xin Jiang, Ph.D.,Molecular Devices, LLC (2011)