實驗概要
hESCs的分離及建系
主要試劑
hESCs培養液、DPBS、0.25%Trypsin、1 mg/mL膠原酶Ⅳ、絲裂霉素C、0.1%明膠、囊胚培養液G2、胚胎凍存液、細胞基礎培養液
主要設備
35 mm培養皿、4孔培養板、濾器、注射器針頭；2 mL、5 mL、10 mL、15 mL、25 mL、50 mL離心管、計數器、巴斯德管、倒置顯微鏡、生物安全柜、體視鏡
實驗材料
人5-7 天的植入前胚胎【胚胎干細胞的建系通常是使用做試管嬰兒之后剩余的胚胎，解凍之前要征求捐贈者的同意或之前簽訂相關知情同意書等協議】
實驗步驟
（1）胚胎復蘇和培養
①裝有胚胎的凍存管從液氮取出之后在室溫中靜置30 s，然后轉入30℃的水浴鍋中30～40 s。
②將胚胎在0.5、0.2和0.1 M蔗糖的凍存液中孵育10 min。
③之后在室溫和37℃的凍存緩沖液中分別孵育10 min。
④在囊胚培養液G2中進行培養。
！注意：復蘇凍存的胚胎是一個繁瑣的過程，只有嚴格按照上述步驟才可能獲得較高質量的胚胎。
（2）飼養層細胞的復蘇
飼養層細胞的制備見本章第二節絲裂霉素C制備飼養層，飼養層細胞的復蘇見第二章細胞復蘇的常規方法，在胚胎接種前1~2天復蘇細胞，細胞密度約為7x104~2×105/cm2。
！注意：建系過程中飼養層的密度和質量非常重要，建議用CF-1品系的飼養層。飼養層是培養胚胎干細胞的關鍵之一，品系和密度同時影響胚胎干細胞的質量，建系的飼養層細胞的密度約為7×104/cm2。
（3）內細胞團的分離與接種
①在35 mm培養皿內用hESCs培養和建系液做幾個20～30μL的液滴。
②用口控吸管將囊胚移入上述液滴中。
③用兩個28
G的注射器針頭調整胚胎的位置，使胚胎內細胞團處于焦面并在0點鐘位置，然后用玻璃針【鑷子夾住1.0×0.8
mm規格的玻璃管在酒精燈上烘烤滅菌；用左手持鑷夾住玻璃管左端，右手拿住右端，用酒精燈外焰烘烤左端，待玻璃管融化時，左右手分別向外快速成120°角抻拉，斷開后，右手端持取的玻璃管就可用于克隆挑取相關實驗。】將透明帶劃開。
！注意：玻璃針在hESCs建系和傳代過程中會頻繁使用，根據不同的用途，可以隨時調整玻璃針的大小，韌度和形狀。
④調整胚胎的位置，一個針頭進行固定，一個針頭沿著內細胞團的平行界面將胚胎切為兩部分，吸出含有內細胞團的部分，放入盛有hESCs培養液的鋪有飼養層的培養板中。
！注意：建系時一般用24孔培養板，形成Outgrowth后挑克隆，一個克隆接種到一個24孔培養板的孔，隨著傳代克隆逐漸增多，所用培養板逐漸調整到12孔培養板，6孔培養板，hESCs的穩定傳代一般用6孔培養板。
⑤4～6天后可以發現有相應的克隆狀細胞團，這時可以用玻璃針【鑷子夾住1.0×0.8mm規格的玻璃管在酒精燈上烘烤滅菌；用左手持鑷夾住玻璃管左端，右手拿住右端，用酒精燈外焰烘烤左端，待玻璃管融化時，左右手分別向外快速成120°角抻拉，斷開后，右手端持取的玻璃管就可用于克隆挑取相關實驗。】挑取較致密的克隆。
⑥前10代一般都需用機械法傳代【用玻璃針將培養5-7天的hESCs克隆切成很多小的克隆，然后吸出，放入新鮮的培養液中。】，用玻璃針挑出較致密的克隆。
！注意：機械切割不宜操作時間過長，防止hESCs培養液的滲透壓發生變化進而影響到胚胎質量。
每個胚胎用單獨的針頭，防止交叉污染。
胚胎切割動作要快，防止粘針。
可以調整胚胎以確定內細胞團的位置。
內細胞團種入三天內勿動培養皿，這樣更利于細胞貼壁。