這個方案只是用 RNA 酶處理 PCR 產物的一種方法。有很多可選擇和有效的途徑來純化 PCR 產物以除去引物，接著用酶處理 PCR 產物，然后再除去酶。值得注意的是用 PCR儀設置溫浴程序是很方便的。可以在加熱步驟完成后選擇加上“冷卻”步驟，即在冷模塊中放置 5 min 甚至過夜。本實驗來源于 PCR 實驗指南（第二版），作者：種康，瞿禮嘉。
| 試劑、試劑盒 | ATEN 緩沖液DNA 緩沖液（TEN)KLA 緩沖液T5E5Dpn IKlentaq LA蛋白酶 K蛋白酶K儲存緩沖液RNA 酶 A設計好的載體已經進行 5'端生物素-TEG 修飾并且 3'端核糖胞嘧啶或者核糖尿嘧啶修飾過的引物卡那霉素（Sigma)四環素Ticarcillin |
|---|
| 儀器、耗材 | 電轉化儀器PCR(薄壁）試管管壁厚度規則的試管鏈霉抗生物素蛋白珠子 |
|---|
| 實驗步驟 | —、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑.
10XATEN 緩沖液
0.5mol/LTris-HCl,pH7.9
2.5mol/L 氯化鈉
0.25mol/L Na4EDTA,pH7.9
甜菜堿（SigmaB-2629)
藍色葡聚糖（bluedextran)(SigmaD-5751)
DNA 緩沖液（TEN)
10mmoI/LTris-HCl,pH7.9
10mmol/L 氯化納
0.1mmol/L EDTA
乙醇, 用 25% 的 DNA 緩沖液配成 75%
10X KLA 緩沖液
500 mmol/L Tris-HCl 堿 (Sigma;TrizmaBase)
160 mmol/L 硫酸銨
1%Tween20
25 mmol/L 氯化鐵
未調整前 pH 為 9.2, 逐滴加入鹽酸調整 pH 到 7.9，單獨取出液滴來檢測 pH, 以防 pH 計探針上的DNA 污染緩沖液。
30% 聚乙烯乙二醇 3350(PEG),1.5mol/L 氯化鈉
乙酸鈉，3mol/L，pH5.6
T5E5
5 mmol/L Tris-HCl,pH7.9
5 mmol/L Na4EDTA,pH7.9
2. 酶和酶緩沖液
Dpn I
Klentaq LA(Barnes1994；Clontech8421-1)
蛋白酶 K(Roche1373196)
蛋白酶 K 儲存緩沖液
100umol/L β-巰基乙醇
20 mmol/L Tris-HCl，pH7.9
1mmol/LCaCl2
50%(體積分數）甘油（630 g/L)
RNA 酶 A(Ambion2270 或 2272)
3. 核酸和寡核苷酸
設計好的載體
已經進行 5'端生物素-TEG 修飾，并且 3'端核糖胞嘧啶或者核糖尿嘧啶修飾過的引物
4. 抗生素
卡那霉素（Sigma), 終濃度為 25ug/ml
四環素 (Calbiochem)，終濃度為 12ug/ml
Ticarcillin(SmithKline Beecham)，終濃度為100ug/ml
5. 專用設備
電轉化儀器
PCR(薄壁）試管；管壁厚度規則的試管；0.5 ml 或 1.7 ml
鏈霉抗生物素蛋白珠子
6. 細胞和組織
電擊感受態細胞（Dower et al.1988;Invitrogen 18290-015)
二、方法
1. 應用末端為核糖胞嘧啶或者核糖尿嘧啶的引物和 KLA 緩沖液（PH7.9) 分別在1.3mol/L 和 1.9mol/L 的甜菜堿中擴增目標片段和載體序列。一些載體的質粒復制子在 pH9.2 條件下標準的長 PCR 反應中擴增得更好，但是 colEl 復制子在 pH7.9 條件下擴增得好。
為了得到最佳的擴增效率，應該使用已經進行 5'端生物素-TEG 修飾過的引物和如下所述的鏈霉抗生物素蛋白珠子，與其他 DNA 聚合酶相比，Klemaq LA 酶混合物（BameS1994) 得率更高，而且它對甜菜堿的抗性更強（Baskaran et al.1996)。
以質粒做模板的 PCR 效率稍高，并且如果在 PCR 之前用限制酶將模板線性化，模板轉化進大腸桿菌細胞造成的最終背景要低些。
如果用來擴增栽體或目標片段的模板來自 dam+大腸桿菌，Dpn I 選擇通常是個好的辦法，并且可能會導致后續克隆步驟中出現不必要的背景。Dpn I 不能酶切 PCR 產物，因為含有非甲基化的 GATC 位點 (Weiner et al.1994)。
2. 向每個100ul 的 PCR 反應中，加入 1ul(10U)Dpn I,37°C 溫浴 2 h。
這種處理可以把單純載體或單純目標片段的背景降到 0~20 個菌落。
3.PEG 沉淀步驟。這步的目的是要除去引物和鹽。把 PCR 反應移到厚壁（管壁厚度均勻）試管，0.5 ml 或 1.7 ml 都可以，因為薄壁 PCR 試管不能用來離心。然后，加入 5ul lmg/ml 藍色葡聚糖（用它來顯示沉淀的位置）和 1/2 體積 30%PEG3350、1.5mol/L 氯化鈉（最終為 10%PEG，0.5mol/L 氯化鈉）。室溫放置 30 min 或 4°C 過夜。離心 15 min。看著藍色沉淀倒去上清液，以免不小心倒掉沉淀。如果沉淀很薄看不見，盡董避免倒掉沉淀，但是同時保留上清液。用 75% 乙醇淋洗沉淀，離心 8 min。在空氣中干燥沉淀 10~20 min。用 100ul 的 T5E5 緩沖液重懸沉淀，置于冰上至少 lOmin, 并不時振蕩。
4. 胰腺 RNA 酶 A 步驟。用 T5E5 緩沖液稀釋 200ugRNA 酶 A 到 200ug/ml。也可以使用 DNA 緩沖液（E.Oates，個人交流）。向每 100ul 的 PCR 產物中加入 6ug（30ul)RNA 酶，振蕩并輕輕離心。然后把含有 RNA 酶的 PCR 產物放在 55°C 溫浴 30 min，冷卻。
5. 蛋白酶 K 步驟。應該用蛋白酶 K 保存緩沖液將酶在-20°C 保存（見材料單）。加入 5ug 蛋白酶 K 或大約相同質量（6ug) 的上述 RNA 酶，充分混合，稍微離心一下，65°C 溫浴 30 min，冷卻。
如果使用生物素引物，立即逬行下述的珠子純化步驟。否則 DNA 就已經準備好了。
6. 克隆步驟。取 2~8ul 的載體或目標片段樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，并在旁邊加一個濃度標準，用來同時確定載體 DNA 和目標片段的濃度。克隆時它們的物質的量應該相等，濃度是否精確并不重要。
1~10ul 載體=30~100ng，0.02pmol
1~10ul 目標片段=5~25ng(目標片段和載體物質的量相等）
加入 1XATEN 緩沖液至 40ul
7. 各取 20ul 克隆混合物作不同的對照，比如在加熱前、沒有加熱、凝膠樣品等的對照。按比例配制更多所需的克隆混合物。最小用 40ul:20ul 做凝膠電泳，20ul 用來轉化細胞。
8. 珠子純化的 DNA 可不需要退火，因為它似乎在室溫下可以進行自組裝（數據沒有給出），但是這個加熱步驟對非生物素引物非常有幫助。
78°C 溫浴 2 min, 然后 52°C 溫浴 30 min; 或者，先 78°C 溫浴 2 min，再 65°C 溫浴 lOmin, 然后在大于 30 min 的時間內慢慢地把溫度降到 52°C 或者更低，冷卻。保存 20ul 用作退火后凝膠檢測樣品。
這些凝膠樣品可以用來檢測和提高重組效率。常規克隆時可以跳過這步不做，但是，就像做任何 DNA 克隆實驗一樣，如果出錯了，實驗者不做凝膠分析就不知道是什么發生了錯誤.
9. 加入 1/9 或者 1/6 體積的 3mol/L 乙酸鈉（pH5.6) 和 2 mg 藍色葡聚糖，加入 2~3 倍體積的乙酵沉淀 DNA, 在-20°C 冷藏至少 30 min, 然后離心 10~15 min。用 75% 乙醇：25%DNA 緩沖液淋洗可見的沉淀，然后離心 8 min。在這步 75% 乙醇淋洗中，在 DNA 緩沖液中加入了少量的鹽，這樣 25bp 的黏性末端就不會在下面的步驟中解鏈。
10. 在冰上用 22ul 的水重懸干燥的沉淀，加入的水會由于藍色葡聚糖變成輕微的藍色。
取出用作電泳樣品或者作為轉化的備份。
11. 用 15ul 的 DNA 去電擊轉化 70ul 的電擊菌感受態，在 5s 中之內加入 1ml 的豐富培養基，然后將其涂在恰當的抗生素培養基上：10min 后涂在 100ug/ml 替卡西林板上，或者 30°C 5~16 h 后涂在 25ug/ml 的卡那霉素板上，或者在 30°C 2 h 后涂在 12ug/ml 的四環素平板上。延長電轉化后的培養時間對于表達一些抗生素基因的抗性是必需的。 展開 |
|---|
