一、RNAi的分子機制
通過生化和遺傳學研究表明，RNA干擾包括起始階段和效應階段(inititation and effector steps)。在起始階段，加入的小分子RNA被切割為21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。證據表明；一個稱為Dicer的酶，是RNase III家族中特異識別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導入或者由轉基因，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個片段的3’端都有2個堿基突出。
在RNAi效應階段，siRNA雙鏈結合一個核酶復合物從而形成所謂RNA誘導沉默復合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一個ATP依賴的將小分子RNA解雙鏈的過程。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉錄本上，并在距離siRNA3’端12個堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機制尚不明了，但每個RISC都包含一個siRNA和一個不同于Dicer的RNA酶。
另外，還有研究證明含有啟動子區的dsRNA在植物體內同樣被切割成21-23nt長的片段,這種dsRNA可使內源相應的DNA序列甲基化,從而使啟動子失去功能,使其下游基因沉默.
二、如何進行RNAi試驗
(一)siRNA的設計
1. 在設計RNAi實驗時，可以先在以下網站進行目標序列的篩選：
http://www.genesil.com/business/products/order2.htm
http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html
http://www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.html
http://design.dharmacon.com/rnadesign/default.aspx?SID=45358710
2.RNAi目標序列的選取原則：
(1)從轉錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3'端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。有研究結果顯示GC含量在45%―55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。
Tuschl等建議在設計siRNA時不要針對5'和3'端的非編碼區（untranslated regions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調控蛋白結合區域，而這些UTR結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNP核酸內切酶復合物結合mRNA從而影響siRNA的效果。
(2)將潛在的序列和相應的基因組數據庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。
例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）
(3)選出合適的目標序列進行合成。通常一個基因需要設計多個靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。
3.陰性對照
一個完整的siRNA實驗應該有陰性對照，作為陰性對照的siRNA應該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結果以保證它和目的靶細胞中其他基因沒有同源性。
4.目前已證實的siRNA可以在下面的網頁找到：
http://design.dharmacon.com/catalog/category.aspx?key=49
http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_502.html
http://web.mit.edu/mmcmanus/www/siRNADB.html
http://python.penguindreams.net/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Published
二)siRNA的制備
目前為止較為常用的方法有通過化學合成，體外轉錄，長片斷dsRNAs經RNase III 類降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)體外制備siRNA，以及通過siRNA表達載體或者病毒載體，PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達產生siRNA。
1． 化學合成生產siRNA
優點：方便，研究人員幾乎不需要做什么工作。
缺點：價格較貴，效率只有轉錄合成的shRNA的1/10-1/40，基因抑制持續時間短，對細胞毒性大，轉染效率低，此外由于合成工藝上存在不可彌補的缺陷，此方法不能合成shRNA，不能糾正合成中產生的20%左右的堿基錯誤。
適用于：建議不再采用此種合成方法。
不適用于：基本上對目前所有的實驗室來說均不適用。
評價：☆☆☆☆☆
2． 生物合成轉錄生產編碼siRNA
優點：價格較低，抑制效率高，低濃度的siRNA即可達到抑制效果。體外轉錄合成，比較接近生理狀態。
缺點：無法保證有效性，實驗規模受到限制，不能進行大量的生產，不能維持長時間抑制效應，而且需要用戶參與操作，難以保證實驗的一次成功性。
適用于：篩選siRNAs特別是需要制備多種siRNAs，考慮合成價格時。
不適用于：實驗需要大量的一個特定的siRNA。長期研究。
評價：★★★☆☆