解析人源松弛素／胰島素樣肽受體4復合物三維結構

　　人源松弛素/胰島素樣肽受體4（Relaxin family peptide receptor 4，RXFP4）為A類G蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptor，GPCR），2003年首見于人類基因組數據庫，2005年被證實為胰島素樣肽5（Insulin-like peptide 5，INSL5）的內源性受體。INSL5屬于松弛素/胰島素超家族。1999年，Conklin等在研究該超家族保守的B鏈半胱氨酸基序（Motif）時，通過檢索人類表達序列標簽（Expressed sequence tags, EST）數據庫發現，二者均高表達于結直腸組織。INSL5/RXFP4還參與調控能量代謝、食欲調節和腸道蠕動等生理功能。目前，尚未解析RXFP4與內源性配體或活性小分子配體的復合物三維結構。

　　1月30日，復旦大學基礎醫學院講席教授王明偉聯合中國科學院上海藥物研究所研究員柳紅/楊德華領銜的團隊，在《自然-通訊》（Nature Communications）上，在線發表了題為Ligand recognition mechanism of the human relaxin family peptide receptor 4 (RXFP4)的研究論文。該研究首次報道了RXFP4分別結合內源性配體INSL5、小分子RXFP4/RXFP3雙激動劑Compound 4及小分子RXFP4選擇性激動劑DC591053與Gi蛋白形成復合物的高分辨率冷凍電鏡結構，闡明了INSL5獨特的受體識別模式，揭示了Compound 4擬肽作用的關鍵位點和DC591053受體亞型選擇性的分子機制。

　　合作團隊利用大腸桿菌表達、高密度發酵和專有蛋白純化技術批量生產INSL5，為結構解析奠定了堅實的物質基礎。通過對柳紅課題組已構建的四氫異喹啉類優勢骨架化合物庫進行藥理活性篩選，以及基于四氫異喹啉母核開展多輪結構優化，研究發現了非肽類RXFP4選擇性激動劑DC591053（pEC50 = 7.24 ± 0.12）。王明偉課題組和楊德華課題組在NanoBiT系連技術的助推下獲得了分別與上述三種不同配體結合、顆粒均一和性狀穩定的RXFP4–Gi蛋白復合物，并通過300 kV冷凍電鏡所拍攝的清晰圖像和后繼單顆粒三維重構，解析了分辨率各自為3.19埃、3.03埃和2.75埃的INSL5–RXFP4–Gi、Compound 4–RXFP4–Gi及DC591053–RXFP4–Gi三個復合物的分子結構（圖1）。

　　研究顯示，RXFP4識別INSL5的方式不同于已報道的A類GPCR：INSL5 B鏈羧基末端的α-螺旋深入受體跨膜域（Transmembrane domain，TMD），而A鏈則覆蓋正構位點從而維持配體的完整性和結構穩定性。特別是B鏈羧基末端的R23B與RXPF4上的E1002.63（右上標數字為Ballesteros–Weinstein編號，用于確定TMD氨基酸的相對位置）形成鹽橋，而W24B除了與T1213.32、Q2055.39和R2085.42等殘基形成眾多極性作用網絡外，亦可與W972.60及H2997.43發生與受體激活密切關聯的堆疊效應（圖2）。人為突變E1002.63、T1213.32和R2085.42導致INSL5完全失活，破壞W972.60、Q2055.39和H2997.43等殘基也不同程度地影響了RXFP4的活化。

　　非選擇性激動劑Compound 4能深入RXFP4的結合口袋，其胍基模擬INSL5的B鏈R23B與RXFP4上的E1002.63形成鹽橋，而吲哚母核則模擬W24B的吲哚環與周圍殘基形成廣泛的相互作用；該小分子配體對RXFP4的激活能力在發生W972.60、E1002.63、T1213.32與H2997.43等殘基的突變后顯著降低（圖3a-b）。然而，選擇性激動劑DC591053則展現了與Compound 4迥異的結合方式，其嗎啉環占據RXFP4獨特的配體結合口袋（圖3c-d），在3.29、3.33、5.39、5.42和7.39等位點上（Ballesteros–Weinstein編號）與RXFP3的氨基酸差異明顯，與亞型選擇性相關（圖3e）。上述成果得到了功能性實驗數據的支持：置換RXFP3和RXFP4上述同源位點的氨基酸，Compound 4對RXFP4突變體L1183.29S+V1223.33S的作用沒有顯著變化，但DC591053的效價卻降低20.9倍；較之Compound 4，DC591053激活Q2055.39H和R2085.42K等RXFP4突變體的能力也受到更大影響。

　　該工作有助于探索RXFP4的生理功能和開發高效的選擇性RXFP4小分子激動劑，并有望提升科學家對胰島素超家族成員多元識別相關受體的認知。研究工作得到國家自然科學基金委員會、科技部、國家衛生與健康委員會、中科院和上海市科學技術委員會等的支持。臨港實驗室、澳大利亞墨爾本大學等的科研人員參與研究。

圖1.RXFP4–Gi分別結合INSL5、Compound 4和DC591053的冷凍電鏡結構。a、INSL5–RXFP4–Gi復合物結構；b、Compound 4–RXFP4–Gi復合物結構及Compound 4的化學結構；c、DC591053–RXFP4–Gi復合物結構及DC591053的化學結構。

圖2.RXFP4識別INSL5的結構基礎。a、INSL5與RXFP4結合的整體示意圖；b、INSL5的B鏈羧基末端R23B和W24B深入RXFP4的正構位點并形成多個極性相互作用；c-e、RXFP4胞外環參與INSL5的識別。

圖3.小分子激動劑的擬肽作用及和DC591053選擇性激活RXFP4的分子機制。a、Compound 4的結合口袋截面圖；b、Compound 4與RXFP4的相互作用；c、DC591053特異性激活RXFP4；d、DC591053結合口袋截面圖；e、小分子激動劑與受體相互作用模式示意。