基于紙噴霧電離離子淌度質譜在乳腺癌診斷中的應用

　　乳腺癌是全球女性最常見的癌癥之一，也是導致女性癌癥相關性死亡的主要原因之一，因此早期的發現和診斷對于提高乳腺癌預后和生存率至關重要。目前乳腺癌的篩查方法包括臨床乳腺檢查、X光、超聲和核磁共振成像等。乳房X光和超聲常用于篩查無明顯癥狀的乳腺癌，如果檢查顯示異常，就需要進行穿刺活檢進一步確診。穿刺活檢是獲取組織樣本進行病理檢查的常用方法，活檢樣本通過蘇木精-伊紅染色(HE）或免疫組化染色(IHC)后由病理醫生在顯微鏡下對樣本進行評估。整個過程不僅耗時（通常需要1-2周），還可能出現誤判，這都會給患者帶來一定的生理和心理負擔，甚至延誤病情。因此，開發一種可在數分鐘內完成乳腺癌快速靈敏的診斷手段非常必要。

　　 質譜通過檢測一些分子生物標志物成為疾病早期診斷非常有潛力的工具，如大氣壓離子化質譜(AIMS)，該技術在大氣壓下操作，只需很少的樣品就可實現原位、實時、快速的標志物檢測，并大大減少對患者的侵襲性和診斷時間，在癌癥診斷方面具有巨大潛力，包括解吸附電離技術(DESI)、實時直接分析技術(DART)、紙噴霧電離技術(PSI)等。然而，AIMS常受到較強的基質效應干擾，往往需要與其他分析技術聯用。離子淌度質譜(IMMS)根據待測物離子遷移率的不同增加了一維分離模式，主要有漂移管IMS (DTIMS)、行進波IMS (TWIMS)和場非對稱波IMS (FAIMS)三種類型。目前小型化的FAIMS儀器已經商品化，它可以很容易地與AIMS儀器連接，二者結合可以顯著提高代謝物的檢測覆蓋率和準確性。

　　 最近Huang YC等人建立了一個紙噴霧電離-場非對稱波離子淌度質譜（PSI-FAIMS-MS）平臺技術檢測乳腺穿刺活檢標本，該平臺可方便地應用于醫院的常規臨床檢查。如圖1所示，臨床醫生使用穿刺針抽吸組織樣本后，只需將組織擦拭到層析紙上，然后交由質譜分析人員檢測即可。與傳統的HE染色法相比，整個采樣分析過程可在一小時內完成，診斷用的特征性代謝物可被高靈敏地檢測，具有令人滿意的預測準確性，并且可實現樣本的高通量檢測。

圖1 乳腺穿刺活檢采集及PSI-FAIMS-MS代謝物輪廓表征示意圖

　　 研究者收集了202例乳腺穿刺活檢樣本及其標準病理診斷報告，并使用建立的PSI-FAIMS-MS平臺技術進行分析。首先，研究者在正離子檢測模式下通過優化不同的FAIMS條件，包括分散場強度（DF）和補償場強度（CF），增強極性小分子代謝物的信號強度（試驗I：43例乳腺穿刺活檢樣本，29例為良性，14例為惡性）和脂質代謝物的信號強度（試驗II：159例乳腺穿刺活檢樣本，117例為良性，42例為惡性）。為驗證FAIMS的作用，每個樣本的質譜數據均在FAIMS-off和FAIMS-on兩個條件下采集，每個樣品的采集時間小于5分鐘，獲得10?20個譜圖。典型的良性和惡性乳腺組織的PSI-FAIMS-MS圖如圖2所示，可見兩種組織的MS圖呈現出較大差異。

　　 通過比較良性和惡性乳腺組織的MS圖，發現乳腺癌診斷潛在的生物標志物。然而，在組織樣本中獲得的質譜數據非常龐大，因此，研究者對數據的挖掘采用了機器學習的方法。該方法從給定的訓練數據集中估算未知的依賴關系，并利用這些依賴關系來預測新的數據集。研究者通過不同的機器學習模型進行評估，發現LASSO模型（Least Absolute Shrinkage and Selection Operator）效果最好。基于此，研究者使用商業化軟件構建了LASSO模型，用于數據的分類和預測。將患者隨機分為訓練組和測試組，比例為7:3。LASSO模型根據每個樣本采集到的質譜數據建立訓練數據集，根據標準病理報告提供的組織類型(良性或惡性)進行分類，然后以每個特征信號(譜圖中的m/z數值和豐度)計算數學權重表征乳腺組織的類型，最后利用獨立測試數據集進行LASSO模型驗證，評價分類模型的性能。

圖2 代表性PSI-FAIMS-MS譜（正離子檢測模式）

(a)良性乳腺組織和(b)惡性乳腺組織

　　 在試驗I中，訓練集和測試集分別包括30和13個樣本。通過優化FAIMS (DF = 220 Td, CF =  -0.1 Td)條件，增強了極性小分子代謝物和脂質代謝物的信號強度。與在FAIMS-off條件下獲得數據通過訓練得到的模型相比，在FAIMS-on條件下，預測精度從61.5%顯著提高到84.6%。這可能是由于過濾了許多無關信號，如溶劑峰或隨機噪聲，如圖3所示，與潛在生物標志物相關的離子信號得到了顯著增強。

　　 LASSO模型將離散離子的m/z值作為乳腺癌特異性模式識別的特征，特征離子權重的絕對值越大，它們在預測組織類型中的作用越顯著。正的權重值表明該特征離子在惡性組織中相對豐度高于良性組織，被認為是癌組織的潛在生物標志物。例如，離子m/z 309.2權重值最大，成為最重要的預測特征離子，通過高分辨質譜和串聯質譜分析，鑒定該離子為N1,N12 -二乙酰精胺的單電荷加鈉離子。此外，m/z 287.2信號被鑒定為N1,N12 -二乙酰精胺的分子離子，也是一個重要的特征離子。已經有文獻報道尿液中N1,N12 -二乙酰精胺作為乳腺癌的診斷和預后標志物。

圖3 不同條件下良性乳腺組織的PSI-MS譜（正離子檢測模式）

(a)FAIMS-off，(b) FAIMS-on：DF = 220 Td, CF = ?0.1Td，(c) FAIMS-on：DF = 220 Td, CF = 1.0Td（脂質信號增強）

　　 在試驗II中，研究者擴大了穿刺活檢樣本集用以進一步驗證LASSO模型的預測性能，訓練集包含111個樣本，測試集包含48個樣本。通過優化FAIMS條件(DF = 220 Td, CF = 1.0 Td)，進一步增強了脂質代謝物信號強度。如圖3所示，在該條件下脂質信號得到最大程度增強，預測精度從79.2%提高到84.6%。另外，隨著樣本量的增加和FAIMS條件的優化，LASSO模型預測的總體準確率達到了87.5%，敏感性從61.5%提高到76.9%，特異性從85.7%提高到91.4%，表明當FAIMS-on時，獲得了更好的相關化合物的信號，提高了模型預測的準確性、敏感性和特異性。圖4是在FAIMS-on（DF = 220 Td, CF = 1.0 Td）條件下基于LASSO模型的權重圖揭示出的特征性代謝物輪廓，可見FAIMS作為一種離子選擇和過濾器提高了標志物的表征能力，并且通過多種生物標志物組合譜代替單一的生物標志物可以更有效地提升對乳腺癌的診斷性能。

　　 此外，研究者還使用LC-HRMS/MS鑒定了乳腺組織中的特征脂質代謝物。例如，惡性乳腺組織中發現的相對豐度較高的特征離子m/z 806.5和m/z 741.5，初步鑒定為PE(20:4/18:0)和PG(14:1/18:1)；惡性乳腺組織中相對豐度較低的特征離子m/z 758.6和m/z 756.5被鑒定為PC(16:0/18:2)和PC(32:0)。許多鑒定到的代謝物是已被報道的乳腺癌相關的特征代謝物。

圖4 在FAIMS-on（DF = 220 Td, CF = 1.0Td）條件下基于LASSO模型的權重圖揭示出特征性代謝物

　　 綜上，研究者開發了一種用于穿刺活檢的代謝物輪廓分析的PSI-FAIMS-MS平臺技術，結合機器學習用于乳腺癌診斷。研究結果表明，該方法獲得的代謝產物譜可用來區分乳腺活檢樣本的良性/惡性。與常規病理學診斷相比，該方法操作簡單，借助于分類模型，僅需數分鐘即可獲得預測結果，且準確性達到87.5%。未來，通過獲得更多臨床樣本的數據集，可能會實現一種診斷更準確成本更低廉的解決方案，成為臨床上快速、廉價、智能的乳腺癌診斷手段。

　　參考文獻

　　Huang YC, Chung HH, Dutkiewicz EP, Chen CL, Hsieh HY, Chen BR, Wang MY, Hsu CC. Predicting Breast Cancer by Paper Spray Ion Mobility Spectrometry Mass Spectrometry and Machine Learning. Anal Chem. 2020, 92(2): 1653-1657.