PCR擴增產物的電泳分析

凝膠電泳分瓊脂糖電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳兩種。

一、瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳是一種非常簡便、快速、最常用的分離純化和鑒定核酸的方法。瓊脂糖是從海藻中提取的一種線狀高聚物。根據瓊脂糖的溶解溫度，把瓊脂糖分為一般瓊脂糖和低熔點瓊脂糖。低熔點瓊脂糖熔點為62～65℃，溶解后在 37℃下維持液體狀態約數小時，主要用于DNA片段的回收，質粒與外源性DNA的快速連接等。

1、凝膠濃度

凝膠濃度的選擇依DNA分子的大小而定。

瓊脂糖凝膠的濃度與DNA分離范圍

2、電泳緩沖液

核酸電泳緩沖液有三種，即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE)。TBE 與TPE緩沖容量高，DNA分離效果好，但TPE在DNA片段回收時含磷酸鹽濃度高，容易使DNA沉淀。TAE緩沖容量低，但價格較便宜，因而推薦選用TBE.緩沖液中的EDTA可螯合 二價陽離子，從而抑制DNA酶的活性，防止PCR擴增產物降解。

10XTBE緩沖液的配制：Tris鹼，108克 EDTA，9.3克 硼酸，55克 H2O至，1000ul (其PH應為8.0～8.2) 臨用時用水稀至0.5XTBE(20倍稀釋。

3、核酸電泳的指示劑與染色劑

1）指示劑：核酸電泳常用的指示劑有溴酚蘭和二甲苯青及銀染色。

溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，在0.6%、1%、1.4%和2%瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚蘭的遷移率分別與1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的雙鏈線性DNA片段大致相同。

二甲苯青的水溶液呈蘭色，它在1%和1.4%瓊脂糖中電泳時，其遷移速率分別與2Kb和1.6Kb的雙鏈線性DNA大致相似。

指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液。載樣緩沖液的作用有①增加樣品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加樣孔內。②在電泳中形成肉眼可見的指示帶，可預測核酸電泳的速度和位置。③使樣品呈色，使加樣操作更方便。

2）染色劑：核酸電泳后，需經染色后才能顯現出帶型，最常用的是溴化乙錠染色法，其次是銀染色。

溴化乙錠(ethidium bromide，EB)是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發下，發出紅色熒光。根據情況可在凝膠電泳液中加入終濃度為0.5ug/ml的EB，有時亦可在電泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色10～15min.瓊脂糖凝膠EB染色，肉眼可見核酸電泳帶，其DNA量一般>5ng，當溴化乙錠太多，凝膠染 色過深，核酸電泳帶看不清時，可將凝膠放入蒸餾水浸泡30min后再觀察。

銀染色液中的銀離子(Ag+)可與核酸形成穩定的復合物，然后用還原劑如甲醛 使Ag+還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色。 也用于瓊脂糖凝膠染色。其靈敏度比EB高200倍。但銀染色后，DNA不宜回收。

4、電泳

1）電泳裝置：電泳裝置主要有電泳儀，電泳槽及灌膠模具等。

2）電泳方法

①用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗干凈。放在水平桌面上，并架好梳子。

②根據核酸分子量的大小配制不同濃度的瓊脂糖凝膠，一般200～400bp的DNA片段， 可配制1.2～1.7%濃度的瓊脂糖用于電泳。

③配制0.5XTBE電泳緩沖液100ml于三角燒瓶中，稱取一定量的瓊脂糖粉放入后沸水鍋或微波爐內加熱熔化。冷卻至60℃(需要時可加入溴乙錠)，倒入電泳槽中，待凝固。

④向電泳槽中倒入0.5XTBE，其量以沒過膠面2mm為宜，小心移去梳子。如樣品孔內有氣泡，應設法除去。

⑤在DNA樣品中加入0.2體積的載樣緩沖液，混勻后，加入樣品孔內。

⑥接通電源，一般紅色為正極黑色為負極，切記DNA樣品由負極往正極泳動(靠近加樣 孔的一端為負)。電壓為1-5V/cm(長度以兩個電極之間的距離計算)。

⑦根據指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳。一般200～400bp的PCR產物50V電壓， 電泳20～40min即可。

3）溴化乙錠染色后，紫外儀上觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標準比較被擴增產物的大小。