流式細胞術（Flow Cytometry，FCM）是一種對液流中排成單列的細胞或其它生物微粒（如微球，細菌，小型模式生物等）逐個進行快速定量分析和分選的技術。作為應用流式細胞術進行檢測的技術平臺，現代流式細胞儀產生于上世紀六七十年代。經過近四十年的發展和完善，今天的流式細胞儀已經十分成熟，并被廣泛的運用于從基礎研究到臨床實踐的各個方面，涵蓋了細胞生物學、免疫學、血液學、腫瘤學、藥理學、遺傳學及臨床檢驗等領域，在各學科中發揮著重要的作用。
現代流式細胞術綜合了流體力學技術、激光技術、電子物理技術、光電測量技術、計算機技術、熒光化學技術及單克隆抗體技術，是多學科多領域技術進步的結晶。隨著現代科技的高速發展，為了滿足生命科學對細胞分析更高層次的要求，流式細胞技術仍然在快速發展，并已經在檢測技術、分選技術及高通量分析等方面取得了許多突破。本文就流式細胞術的最新進展做一些介紹。
圖1. ImageStream流式細胞成像系統及其工作原理
一、流式細胞檢測與細胞成像的結合
使用傳統的流式細胞檢測技術，研究人員可以分析成千上萬個細胞，獲得每個細胞的散射光信號和熒光信號的數值，從而得到細胞群體的各種統計數據，并可以找到稀有的細胞亞群。但是傳統流式細胞檢測技術仍然存在局限，那就是獲得的細胞信息很有限。細胞對研究人員來說，只是散點圖上的一個點，而不是真實的細胞圖像，缺乏細胞形態學、細胞結構及亞細胞水平信號分布的相關信息。要想獲得細胞圖像，研究人員就必須使用顯微鏡進行觀察，但顯微鏡能夠觀察的細胞數量是非常有限的，很難提供細胞群體的量化與統計數據。因此，使用傳統的細胞分析技術，我們就只能面對這樣的兩難選擇，沒有一種技術可以既提供細胞群體的統計數據，又獲得細胞圖像。不過，最近美國Amnis公司推出的ImageStream成像流式細胞儀，給傳統細胞分析帶來突破性的變革。
ImageStream是一種臺式多譜段成像流式細胞儀（Multispectral Imaging Flow Cytometry），能夠同時采集6個檢測通道中的細胞圖像（圖1.）。它將流式細胞檢測與熒光顯微成像結合于一身，既能提供細胞群的統計數據，又可以獲得單個細胞的圖像，從而提供細胞形態學、細胞結構和亞細胞信號分布的信息。與傳統流式細胞儀很類似，ImageStream也是由液流系統，光學系統和電子系統等三大部分組成(圖一)。液流系統將樣本細胞懸液和系統鞘液注入流動室中，使細胞在鞘液流的約束下聚焦在液流的中心，逐個流過檢測窗口。光學系統中光源照射通過檢測窗口的細胞，從而產生光信號。光源分為兩種，其一是用于產生明場細胞圖像的鹵燈（Brightfield Illuminator），另一種是用于產生熒光細胞圖像的激光器。光源照射細胞產生的光信號被具有很大數值孔徑（NA：0.75）的物鏡收集，然后通過光路系統傳遞到由二向色鏡構成的濾光片堆棧（Dichroic Filter Stack），光信號在這里被分成不同波段投射到一個六通道冷CCD上，產生一個明場細胞圖像，一個暗場細胞圖像（Side Scatter，SSC）及四個不同熒光通道的細胞圖像。ImageStream的光路系統能夠自動調整焦距，并實時測定細胞運動速度，而其冷CCD采用時間延遲積分方式（Time Delay Integration，TDI）進行信號采集，上述這些手段保證了系統采集到的細胞圖像的質量。
ImageStream系統配有功能強大的數據分析軟件 IDEAS（圖2.），可以對每個細胞分析超過500種量化參數。這些參數不僅包括細胞整體的散射光和熒光信號強度，還包括對細胞形態，細胞結構及亞細胞信號分布的分析。通過在細胞群體中對這些參數進行統計，分析軟件可以生成細胞群體的散點圖和柱狀圖，而這些統計數據與細胞圖像是完全整合的，比如點擊散點圖上的點，就可以直觀的看到這個點代表的細胞的圖像。另外，使用者還能夠根據自身研究的特殊需要，進行自定義參數的設定，進行更深入的分析。
圖2. IDEAS分析軟件
ImageStream流式細胞成像系統結合了流式細胞檢測功能與熒光顯微成像功能，并整合了功能強大的分析軟件，幾乎可應用于細胞分析的所有領域，大大深化和拓展了流式細胞術的應用。下面簡要列舉一些 ImageStream的新穎應用。
1. 細胞信號轉導/通路分析 (Cell Signaling/ Pathway Analysis）
細胞信號通路中關鍵因子的磷酸化水平和在細胞內的分布是細胞信號轉導研究的重要內容。ImageStream 系統結合流式細胞術與熒光顯微成像的檢測方式，一方面可以統計細胞內因子的磷酸化程度，一方面可以通過分析細胞圖像來確定信號因子在亞細胞水平定位的變化，因而非常適合進行這方面的研究。
轉錄因子從細胞質轉移到細胞核（ N u c l e a r Translocation）是細胞信號轉導的重要事件。傳統的檢測方法是使用熒光顯微鏡進行觀察，但是這種方法效率很低，所能觀察的細胞數量十分有限，且很難對不同細胞的轉位程度進行評估。為了更有效的檢測Nuclear Translocation，ImageStream系統在IDEAS分析軟件中引入了一個全新的參數—Similarity，來對采集的細胞圖像進行分析。所謂Similarity，是指兩個不同熒光檢測通道采集的熒光圖像在空間分布上的一致性（圖3.）。
圖3. Similarity Feature
Similarity值越高，則兩張細胞圖像上的信號分布越相似。對于Nuclear Translocation研究來說，Similarity值越高，細胞因子轉位的程度就越高。
NF-κB是一類重要的轉錄因子，能夠在多種組織中激活不同基因的表達，與慢性和急性炎癥，自身免疫性疾病及多種癌癥的發生存在著聯系。脂多糖（LPS）能夠激活人類單核細胞系THP-1的一個信號通路，導致NF-κB的轉位。研究人員使用LPS處理細胞， Alexa Fluor 488標記的抗NF-κB抗體和7-AAD染色細胞，利用ImageStream進行檢測。在散點圖上以一定的 Siminlarity值設門，定量分析NF-κB轉位的細胞亞群所占比例，然后通過觀察細胞圖像，確認結果的準確性。分析顯示，LPS處理后，細胞內的NF-κB發生了明顯的轉位，細胞群體的Median Similarity值由-1.358變為 2.114，發生高度轉位的細胞比例從0.72%增加到45.9％（圖4.）。
