Tnnt2-Dre; R26-iCre; IR1小鼠在E8.0天給予Dox誘導標記非肌細胞，發現在E8.5天時在其他組織中被標記上ZsGreen綠色熒光，心肌為紅色熒光標記（圖1E）。接下來收集E13.5天的心臟組織，發現dTomato、ZsGreen和TNNI3（肌細胞marker）的免疫染色顯示E13.5天右心室中的大多數肌細胞是被ZsGreen綠色熒光標記的，說明在胚胎心臟發育早期，非心肌細胞具有分化形成心肌細胞的能力，這些非心胞可以貢獻形成第二心區的心肌細胞（圖1F），證明了新的示蹤系統可以有效檢測發育中的心臟非肌細胞向心肌細胞的轉化。
圖1. E-F
策略1 Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1 非肌細胞對成體心臟中的肌細胞沒有貢獻 使用Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1小鼠來同時追蹤成體心臟中的心肌細胞和非心肌細胞。tdTomato、ZsGreen和TNNI3的免疫染色顯示tdTomato+細胞是TNNI3+心肌細胞，而ZsGreen+細胞不是TNNI3+心肌細胞（圖1G）。
分離Tnnt2-Dre; R26-iCre; IR1的心肌細胞進行體外觀察也沒有檢測到ZsGreen+心肌細胞（圖1H）。
因此，Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1系統用兩種不同的熒光標記了肌細胞和非肌細胞（圖1I）。 圖1.G-I 非肌細胞在成體心臟中是否會分化成肌細胞呢？如果是，那么源自非肌細胞的新心肌細胞將是ZsGreen+的。而實驗結果是：在Dox誘導后，對Tnnt2-Dre;
R26-iCre;
IR1小鼠進行結扎左前降支冠狀動脈誘導MI造模（圖2A）。心肌梗塞后，造成心肌細胞大量死亡，心臟功能受損，在損傷后2-4周，對心臟切片進行ZsGreen、tdTomato和TNNI3免疫染色，結果沒有發現ZsGreen+TNNI3+的心肌細胞（圖2B）。在5個心梗組織的600多個切片中，都沒有檢測到ZsGreen+tdTomato-心肌細胞。流式細胞分析（圖2D）和熒光顯微鏡（圖2E）也證實在Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1小鼠的MI造模后的心臟中也沒有觀察到ZsGreen+心肌細胞。RT-PCR結果也只有tdTomato的表達，沒有ZsGreen的mRNA表達（n=5，圖2F）。這些數據表明，非心肌細胞在成體心臟的心臟損傷后對肌細胞沒有貢獻。 圖2. A-F 平行地，將骨骼肌損傷后骨骼肌中非肌細胞向肌細胞的細胞命運轉化作為陽性對照。骨骼肌在穩態維持過程中，肌纖維細胞與非肌肉細胞發生融合，肌纖維細胞處于多核狀態，因此在正常骨骼肌（假手術組）中，可以檢測到tdTomato+
ZsGreen+肌細胞（圖2G）。而當對Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1小鼠的脛骨前肌（TA肌）實施BaCl2損傷后，骨骼肌中肌纖維細胞大量死亡，TA肌損傷后可以檢測到弱tdTomato熒光信號和強ZsGreen表達，表明在BaCl2造模后ZsGreen+細胞逐漸取代tdTomato+細胞（圖2G）。與假手術組相比，在受損TA肌中可以檢測到ZsGreen+tdTomato-肌細胞（箭頭，圖2G），說明非肌細胞重新形成肌細胞。 圖2. G 綜合上述結果，通過Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1（策略1）的雙同源重組譜系示蹤技術揭示了在胚胎心臟和成體骨骼肌中非肌細胞向肌細胞的轉化，但在成體心臟中非肌細胞對肌細胞沒有貢獻。
策略2 Tnnt2-Cre;R26-DreER;IR3 反向Cre/Dre 系統在非肌細胞向肌細胞轉化研究中標記兩種細胞
設計第2個雙同源重組譜系示蹤系統用來驗證非肌細胞向肌細胞的轉化。該系統由Tnnt2-Cre（肌細胞中表達Cre）、他莫昔芬誘導型 R26-DreER 和IR3報告小鼠組成。利用IR3報告小鼠（見下圖）可排它性地將非肌細胞標記上tdTomato紅色熒光，將肌細胞特異性地標記上ZsGreen綠色熒光。
Tnnt2-Cre;R26-DreER;IR3小鼠就可以同時標記肌細胞（ZsGreen+）和非肌細胞（tdTomato+）（圖3A）。
圖3. A
胚胎E8.0天心臟中ZsGreen主要標記原始心管（圖3B）。E8.0天給予他莫昔芬誘導，在E13.5天的右心室中發現tdTomato+非肌細胞對肌細胞有顯著貢獻（圖3C）。心臟切片免疫染色也證實了此結果（圖3D-F）。
同樣，在成體心臟和骨骼肌中，通過MI和BaCl2造模來觀察非心肌細胞的命運轉化（圖3G）。分離的心肌細胞的流式細胞分析（圖3H）和熒光顯微鏡（圖3I）分別結果也都顯示沒有tdTomato+心肌細胞。在形態上，這些tdTomato+細胞與ZsGreen+心肌細胞也明顯不同（圖3J）。
tdTomato和TNNI3免疫染色顯示這些tdTomato+細胞在MI心臟的梗塞區、邊界區和遠端區均不會轉化為TNNI3+心肌細胞（圖3K）。來自5個Tnnt2-Cre;R26-DreER;IR3小鼠心臟的超過600個組織切片中均未檢測到tdTomato+TNNI3+心肌細胞。RT-PCR結果也同樣指出分離的心肌細胞只表達ZsGreen，不表達tdTomato（圖3L）。