2. GC細胞中FOXD2-AS1富集高的患者預后較差
在芯片數據GSE51575基礎上，以正常組織作為對照，來評估FOXD2-AS1的診斷效果。ROC曲線下面積為0.919（95%置信區間[CI] 0.809-0.976; P < 0.0001）;特異性和敏感性分別為0.885和0.885。此外，發現區分腫瘤組織的臨界值為10.925（△Ct）和AUC為0.709（95% CI 0.643 -0.769; P < 0.0001），特異性和敏感性分別為0.726和0.632。利用Kaplan-Meier (K-M)曲線和log-rank方法分析FOXD2-AS1富集與無病生存(DFS)之間的相關性，發現高富集FOXD2-AS1的患者比低富集FOXD2-AS1的患者預后差。
圖3. FOXD2-AS1與GC患者預后關系
3. FOXD2-AS1是體外和體內的腫瘤誘導因子
為了評估FOXD2-AS1是否能促進GC進展，基于芯片數據GSE51575進行GSEA分析，結果顯示，細胞周期和DNA復制兩個增殖指標與高FOXD2-AS1表達組和低FOXD2-AS1表達組的基因特征最為相關。GO分析揭示了在FOXD2- AS1敲除的細胞中與細胞周期和DNA復制相關的基因的變化。此外，采用qPCR和WB檢測發現FOXD2-AS1富集變化顯著改變了腫瘤發生的關鍵基因的特征，提示FOXD2-AS1可能是胃腫瘤發生的關鍵調控因子。采用基因沉默和過表達的方法，揭示在裸鼠中FOXD2-AS1功能缺失能夠抑制胃癌細胞的細胞周期進程，而FOXD2-AS1的表達上調能夠促進癌癥進展。
圖4. FOXD2-AS1對GC進展的影響
4. FOXD2-AS1通過與EZH2、LSD1相互作用改變EphB3表達
既往研究表明，lncRNA通過RNA結合蛋白調控下游因子，是否FOXD2-AS1介導的調控同樣通過類似的機制發生，研究者利用生物信息學方法結合RIP測序、RNA pull down技術最終驗證了FOXD2-AS1通過與甲基轉移酶EZH2和去甲基化酶LSD1的結合在GC細胞中發揮重要的調控作用。從RNA測序數據來看，FOXD2-AS1減少時，EphB3表達增加。敲除FOXD2-AS2后，發現EphB3表達顯著增加，而異位FOXD2-AS1表達降低了EphB3 mRNA的富集。WB證實了FOXD2-AS1的敲除和過表達在GC細胞中分表上調和下調了EphB3的水平。為了確定FOXD2- AS1是否通過將EZH2和LSD1招募到GC中的EphB3啟動子區來抑制轉錄，這里進行了功能的敲除和回補實驗以及ChIP檢測，發現EZH2和LSD1沉默后，EphB3上調。FOXD2-AS1的敲除降低了GC細胞的結合能力和誘導的修飾，而對照細胞則通過重組shRNA進行轉染。為了觀察FOXD2-AS1是否直接作用于靶色素，我們利用ChIRP方法分離染色質，分析了FOXD2-AS1依賴的EZH2/LSD1靶基因EphB3的位點，并使用qPCR檢測。ChIRP結果顯示FOXD2-AS1被招募到GC細胞的EphB3啟動子中。最后，在GC組織中評估EphB3表達，與FOXD2-AS1呈反比關系，同時，FOXD2-AS1過表達導致的EphB3沉默被同時EZH2或LSD1敲除逆轉。這些結果表明FOXD2-AS1可以將EZH2和LSD1引入到EphB3啟動子中，抑制其轉錄。
圖5. FOXD2-AS1通過與EZH2、LSD1相互作用改變EphB3表達
5.促EphB3表達可抑制GC細胞增殖
數據顯示，相對于正常組織，GC組織中對EphB3的富集顯著降低，低的EphB3表達表明疾病進展。此外，將FOXD2-AS1與EphB3表達結合，可獲得較好的預后價值。使用IHC對106個匹配的GC及周圍正常組織的EphB3蛋白水平進行了評估，發現在約80%的非瘤性胃組織中，EphB3信號呈陽性，且這些腫瘤組織與周圍正常組織相比，大多表現出較低的EphB3蛋白表達。此外，EphB3蛋白表達水平越低，疾病階段越晚期。上述結果表明，低EphB3表達與GC進展有關。EphB3轉染實驗顯示EphB3與FOXD2-AS1誘導的GC細胞增殖有關。拯救實驗驗證了FOXD2-AS1通過阻斷EphB3表達來調控GC細胞生長。
圖6.促EphB3表達可抑制GC細胞增殖
總結：
南京醫科大共同發表的這篇研究成果，為胃癌發生的機制提供了全新的認識。文章揭示FOXD2-AS1可能是胃癌關鍵的腫瘤促進基因，并有可能成為胃癌潛在的生物標志物和治療靶點。回顧全文，從實驗設計、開展，再到數據的分析，每一個思路每一個方法都值得我們學習和借鑒，正確的選擇是成功的一半，這些都離不開云序生物強大的科研團隊所做出的貢獻。
全文信息：
Tong-peng Xu, et al. Upregulation of the long noncoding RNA FOXD2-AS1 promotes carcinogenesis by epigenetically silencing EphB3 through EZH2 and LSD1, and predicts poor prognosis in gastric cancer. Oncogene (2018), http://sci-hub.tw/10.1038/s41388-018-0308-y