試劑、試劑盒 Tris-緩沖液 Tris 三硝基甲苯（Triton） CAT 稀釋緩沖液CAT 酶標準物閃爍液 聚丙烯閃爍杯
儀器、耗材 微量離心管微量離心機
實驗步驟
一、材料
滅菌物品
1. D-PBSA
2. 多孔培養板：6 孔，35 mm
非消毒物品
1. Tris-緩沖液：Tris-HCl，0.1mol/L，pH8.0
2. Tris/三硝基甲苯（Triton）：Tris-HCl，0.1mol/L，pH8.0，0.1%TritonX-100,4℃ 儲存
3. CAT 稀釋緩沖液：Tris-HCl，0.1mol/L，pH8.0，50% 甘油，0.2%BSA
4. 底物：含 250 mmol/L 氯霉素（GIBCO）的 100% 甲醇；分裝，-70℃ 儲存
5. 14C-CoA：14C-丁酸輔酶 A（10μCi/mL；AmershamPharmacia）
6. CAT 酶標準物：制備含 0.2、1.0、2.0、4.0、10U/mL 標準液的 CAT 稀釋緩沖液，4℃ 儲存
7.「雞尾酒」閃爍液：Econofluor（Invitrogen）
8. 去離子蒸餾水（DDW）
9. 聚丙烯閃爍杯：3.5 mL
10. 微量離心管
11. 微量離心機
12. 冰浴
方法A：6 孔、35 mm 培養板上的細胞收集
1. 轉染后 24~72 h，用 D-PBSA 液洗滌細胞。
2. 將培養板置于冰上，每孔中加入 1 mL 的 Tris/Triton。
3. 將培養板-70℃ 冷凍 2 h。
4. 于 37℃ 下解凍培養板，然后將其置于冰上。
5. 將細胞裂解物移至微量離心管中，以最大速度離心 5 min。
6. 收集上清液，65℃ 加熱 10 min，以滅活 CAT 抑制物質。
7. 最大速度離心 3 min 后收集上清液（細胞裂解物），將上清液保存在-70℃。
方法 B：CAT 測定
8. 從每一樣品中取 5~150μL 細胞裂解物，移至一個 3.5 mL 多聚丙烯閃爍杯中，并且加入足夠的 0.1mol/L Tris，終末體積為 150μL。
9. 設空白杯，加入 150μL 0.1mol/LTris 液，作為陰性對照。
10. 陽性對照：
（a）取 5 個閃爍杯，各加入 150μL 0.1mol/LTris。
（b）將 5μL 的 CAT 標準液加入到每個閃爍杯中，繪制 1、5、10、20、50mU 的 CAT 標準曲線。
11. 在所有樣品杯（包括對照）中，加入 100μL 以下混合液：
（a）84μL 超純水
（b）10μL 0.1mol/LTris
（c）1μL 的氯霉素
（d）5μL（50nCi）的 14C-CoA
12. 擰緊杯蓋，于 37℃ 下孵育 2 h。
13. 向所有閃爍杯中加入 3 mL Econofluor，擰緊杯蓋。
14. 上下倒置混勻閃爍杯中成分。
15. 室溫下孵育 2 h。
16. 在一個液閃計數儀上測定 30s 閃爍次數。