一、對照實驗
1．吸收實驗 應用尚無文獻報告的抗血清/自己制備的抗血清進行ICC染色時，需用相應的抗原吸收抗血清后，再孵育標本，判斷結果的可信性（結果應為陰性）。常用的吸收實驗分固相吸收和液相吸收兩種（見本書第一章 ），對于不能形成沉淀，難以用離心沉降法分離的一些小分子多肽類抗原，以固相吸收為佳。一般市售抗體均經特異性檢測，所以應用購買抗體時可省略此步。
2．交叉實驗 我們知道，引起機體免疫應答反應的并非是免疫原整個分子，而是其中的一部份—抗原決定簇。每個抗原可能有不同的抗原決定簇，不同的抗原亦可能有類似的抗原決定簇，因此一種抗血清可能與幾種抗原結合。所以同時最好亦用結構相近的抗原做吸收實驗，以避免抗原間的交叉反應。
3．替代實驗 用制備第一抗體相同種屬的正常血清（1/10或相同IgG濃度）替代第一抗體或用第二抗體相同種屬的正常血清替代酶標抗體/橋抗體或省略其中任何一種免疫試劑或酶等，以PBS代替之，分別孵育切片，結果均應為陰性。
4．置換實驗 應用無關的特異性抗體代替第一抗體，孵育切片，結果應陰性。如果同時進行幾種特異性抗體的ICC染色時，彼此之間即為此類對照。例如，無關的數種抗體，均在相同部位出現類似陽性結果時，非特異性著色的可能性較大，應慎重判斷。
5．陽性對照 不具有ICC染色經驗者，從事此項工作時，最好同時染色已知陽性標本，以排除操作過程失誤所致的染色陰性。陽性標本切片最好冰凍保存備用。
另外，在觀察新的組織抗原時，最好同時比較不同的固定的組織標本、冰凍切處及石蠟切片的ICC染色，選擇最佳條件，以期得到良好的實驗結果。
二、假陽性及其處理
組織成分與各種染色試劑及抗血清之間的非特異性結合稱假陽性，其主要原因和處理方法如下：
1．組織細胞內色素 與DAB沉淀物顏色類似的色素，例如黑質內的神經黑色素，不易與反應產物區別開來。可用其它電子供體或免疫熒光技術鑒別之，亦可改用ALP代替HRP，進行染色。
2．假過氧化物酶活性 RBC內的血紅素輔基有類過氧化物酶活性，當組織內存在紅細胞時，即使不加過氧化酶，亦可出現陽性染色。用甲醇-0.3%H2O2孵育標本15～20min（室溫），能抑制這種假陽性。甲醇可以使血紅素蛋白中的（亞鐵）血紅素游離，后者被H2O2破壞，從而抑制類過氧化物酶的活性。一般認為，RBC的染色容易同其它組織細胞區別，且動物實驗還可通過灌注沖洗組織內的RBC，所以此步往往被省略。
3．內源性過氧化物酶活性 粒細胞、巨噬細胞等存在內源性過氧化物酶，能夠與DAB-H2O2反應，導致假陽性，所以含此類細胞較豐富的脾臟、肝臟、骨髓等組織，ICC染色時，最好做內源性酶阻斷。適當的固定、經酸酒精孵育15～20min，或1%乙酸-甲醇硝基鐵氰化物處理，冰凍切片可用苯肼孵育15～20min，均能不同程度地抑制內源性酶的活性。近年Li(1987)報告，應用0.1%NaN3 0.3%-- H2O2孵10～15min（室溫）能較好地抑制內源性過氧化物酶的活性，冰凍切片效果尤佳。嗜酸性粒細胞內源性過氧化物酶活性較強，上述各種處理后，仍殘留部分活性，此種情況，在DAB-H2O2顯色液中加入終濃度為0.05NaN3,基本上可達到完全阻斷的作用。但是，各種封閉內源性（假）過氧化物酶方法均不同程度地破壞組織的抗原性，所以在不影響反應結果判斷或能夠同內源性酶的反應所致的假陽性區別時，盡量避免此類處理或改用ALP代替HRP進行ICC染色，也可以在用第一抗體與抗原反應結合后，再進行消除內源酶的處理。
4．游離醛基 醛類固定的組織切片上，可能存在些游離醛基，后者能與蛋白質（含IgG）間非特異性結合，導致假陽性，用白蛋白或封閉性阻斷等預先孵育切片，可封閉之。
5．疏水鍵和離子鍵 免疫球蛋白可通過疏水鍵或離子鍵與組織中的堿性蛋白或Fc受體（冰凍切片Fc受體保存尤佳）非特異性結合。用正常血清（制備第二抗體種屬的血清為首選），于第一抗體前孵育切片，可消除之。“4”和“5”重疊應用，更有利于降低背景染色。
6．天然抗體及不純抗體 天然抗體是指因動物自然感染等原因血清中存在的部分抗體：不純抗體是指在制備血清時，所用的抗原不純，獲得的抗體含有雜質抗體。當天然抗體或不純抗體與組織成分結合時，可引起非特異性染色。上述二者的含量均較低，增加第一抗體的稀釋度，可以降低其非特異性染色。
7．載體蛋白抗體 制備小分子多肽（分子量小于4kD）的抗體時，需借助載體蛋白，使小分子多肽獲得免疫原性，刺激動物產生特異性抗體。因載體本身具有抗原性，故動物同時也產生抗載體蛋白抗體，與組織蛋白結合后，引起背景染色。用固相吸收技術，能將載體蛋白抗體除去。一般市售抗體，均經特異性檢測，所以“6”和“7”可不必考慮。
三、抗體有關事項
1．血清特異性檢測 為了發現新的物質或其它方法未能顯示的物質、而又無相應抗體可購買時，往往需要自己制備抗血清。制備時應檢測抗血清的特異性。常用的方法有：
（1）放射免疫分析（RIA）、免疫擴散或電泳及ICC法：在制備抗血清的過程中 ，用RIA和免疫電泳等方法檢測抗血清的效價是不可少的。一般認為，RIA和免疫電泳的最佳稀釋度較高。ICC染色時，應從其1%的稀釋度試用之較合適。在制備ICC用抗血清時，最好在應用RIA和免疫電泳法的同時結合ICC染色，以鑒定抗血清的質量（制備單克隆抗體時，僅用ICC染色篩選特異克隆即可）。因為免疫過程中，各個時期抗血清效價不同的，例如給動物免疫催產素，7周時血清ICC染色較好，RIA不佳；在10～12周期間，RIA效價升高，但ICC染色較差。因此制備ICC用抗血清時，應在ICC染色效價最佳時，收集抗血清。
（2）系列稀釋第一抗體法：在一定稀釋度時，抗體的特異性結合最強；繼續增加抗體的稀釋度，特異性反應將隨之減弱至消失。因此采用系列稀釋第一抗體的方法，能夠驗證抗血清的特異性。
2．抗體的選擇 原則上應選擇在較高稀釋度時染色較佳而背景較低、結果穩定、重復再現良好的抗體。目前供ICC研究用的抗種類繁多，制造商如林，不同的廠家的相同抗體，其價格、包裝及抗體的最佳工作濃度，差異較大。所以選購時，應多聽取有經驗者的建議，參考文獻報告，并且自己應多查找不同廠家的抗體商品目錄，恰當地選購自己所需的抗體。
3．抗體最佳稀釋度的檢測 抗原抗體反應要求一定比例，過量或不足，均不能達到預期的結果，所以ICC染色時，應進行抗體最佳稀釋度的檢測。市售抗體所附說明書均標有工作液濃度，但實際上，廠商常常給較低的稀釋倍數，因此應用時，可將所給工作液濃度稀釋數倍至數百倍再進行系列染色，選擇其中特異性染色最強、背景著色最低的釋釋度作日常ICC染色濃度。在抗體來源不明、又無任何可供參考依據時，則可從原液至數倍稀釋試用。另外，酶標抗體/連結抗體和PAP復合物等也需要確定最佳工作液濃度。一般認為酶標抗體可用稍離濃度，例如HRP標記抗體為1：80～160、ALP標記抗體為1：50～100染色較理想。PAP法染色時，連結抗體稀釋1：50、PAP復合物用1：50～200染色較合適。
4．抗體的保存 為確保ICC染色結果穩定、再現性良好，應避免抗體反復凍融所致的效價降低。第一抗體分裝、冷凍保存為佳，其最小包裝可為每次用量或2周內用量。例如某抗體的工作液濃度1：1000～2000，每次染色需抗體量為1～4ml時，則所需原液為1～2μl。將原液分裝成幾微升難度較大，所以先將原液稀釋為1：10～100，每支離心管內10～100μl保存，應用前稀釋至工作液濃度。后者不宜冰凍，4℃可保存2～3周，原液和1：10～100的抗體在-80℃可保存數年而染色結果不變。單克隆抗體為培養液上清或腹水時，應4℃保存，應早應用。酶標抗體和PAP復合物原液4℃保存1年左右，免疫活性和酶活性不發生改變，大量制備的酶標抗體/PAP復合物最好分裝后于-80℃或-20℃保存。所分裝的抗體，應注明名稱，稀釋度、量及日期等，同時應在筆記本詳細記錄。ICC研究所用的任何抗體及酶，均應嚴格記錄，妥善管理，才能保證實驗成功。
四、單克隆抗體
在單克隆抗體問世前，ICC染色中通常所用的抗血清均為多克隆抗體，即抗血清含有多少B淋巴細胞株所分泌的抗體，這些抗體的性質不完全相同，不同的抗血清之間可能有交叉反應，使ICC染色受到一定限制。近年，單克隆抗體的引入，特別是市售單克隆抗體和種類和數量的迅猛發展，及各實驗者比較容易制備自己所需的單克隆抗體，為ICC染色在特殊抗原定位、生物活性檢測、腫瘤標記識別中，開辟了更廣闊的前景。
1．單克隆抗體的制備（Oi,TV, 1980）(詳見第一章 )。
2．單克隆抗體的特點
（1）酶標抗體：自己制備或市售商的單克隆抗體，絕大部分為小鼠IgG、Kappa型，所以酶標抗體選擇抗小鼠IgG的多價抗體，進行ICC染色比較穩妥。
（2）特異性：專一性強：單克隆抗體是由同一細胞株分泌的，性質均一，且有相同的親合力，識別同一抗原決定簇。這在研究某些類似物質的局部定位、分型、生物活性檢測及腫瘤診斷等方面有重要意義。但同時也應注意，不同抗原的相同抗原決定簇有被識別的可能，所以應結合其它方法，判斷其結果。
（3）不需純化抗原：多克隆抗血清在制備時，要求抗原相當純。而制備單克隆抗體時，不需純化抗原。一些不能純化的組織（游離）細胞可直接免疫，經克隆化，篩選所需細胞株，避免了純化抗原的麻煩，這在研究人類各種疾病等有重要價值。
（4）工作液濃度：不同的單克隆抗體效價各異，所以ICC染色時需檢測最佳稀釋倍數，大量培養純化的抗體可用更高的稀釋倍數。
（5）切片選擇：單克隆抗體僅識別抗原物質的某一抗原決定簇，所以以新鮮組織的冰凍切片為首選。因為在固定過程中，可能使抗原物質發生某些改變，致使其與單克隆抗體反應的抗原決定簇丟失，故擬用石蠟切片固定組織冰凍切片。ICC染色時，在制備單克隆抗體過程中，應該用同樣標本和方法篩選所需細胞株，才能確保染色成功。
（6）特異性檢測：單克隆 抗體的特異性強，性質均一，沒有必要進行RIA分析和吸收實驗等。自己制備的單克隆抗體，其特異性檢測最佳方法為相同組織提取物質進行免疫電泳，確定抗原的分子量等。
（7）發現新物質：在制備腫瘤或其它組織細胞單克隆抗體時，往往有各種各樣的抗原特異性雜交瘤細胞株產生，在篩選過程中，能夠發現一些新的雜交瘤株，經培養制備相應的抗體，用于一些新領域的研究。
五、增加染色強度方法
通常染色、著色較弱時，應想辦法改進標本的處理的抗原的保存，提高抗體的穿透力，再重新染色。但有時組織本身抗原含量較少或標本難得（如手術材料），可嘗試下述方法以提高染色強度，確保染色成功。
1．重復顯色 一般認為，對ALP標記抗體，延長顯色時間其反應可增強。但在同一染色液中延長顯色時間，往往容易產生沉淀，出現終產物彌散現象。所以重新配制顯色液繼續呈色，第二孵育時間可縮短至4～5min，能提高部分染色強度。
HRP標記時，重復呈色無明顯增強效應。通常在顯色液中加入0.01mol/l Imidazole 或改用酸性緩沖液（pH5.5～6.0），可提高染色強度；亦可在DAB反應后，1%OSO4浸泡固定5～15min，繼之0.4%亞鐵氰化鉀/0.1N HCl液處理5min，DAB終產物呈黑色，與背景的對比度較佳。另外，在間接法顯色較弱時，亦可試用PAP法、ABC法等，探索較合適的染色方法。
2．重復第一抗體 在漂洗過程中，結合力弱的抗體易離解丟失，重復應用第一抗體有利于抗體與組織抗原結合，增加抗體數量，提高染色強度（Noorden 1983）。切片經第一抗體孵育后，漂洗，再孵育第一抗體（此時第一抗體可稀釋較原工作濃度1至數倍）2～4h，然后經酶標抗體孵育，呈色觀察同前。所用抗體為多克隆血清時，提高第一抗體的稀釋度，重復孵育2～3次，可得到一定效果。單克隆抗體，經第一抗體—酶標抗體—第一抗體—酶標抗體，也能增加染色強度。
3．雙橋PAP法（Vacca 1982） 基本操作與單橋法相似，所不同的是切片經單橋PAP復合物孵育后，漂洗，再孵育橋抗體和PAP復合物（均可稀釋1倍），即切片經兩次橋抗體、兩次PAP孵育—雙橋法（Double bridged technique）。據報告，第一抗體用較高稀釋度（例單橋法兩倍），也能獲得與雙橋法相近的染色效果。
理論上講，雙橋法是ICC染色中較為敏感的方法，它較單橋法靈敏20～50倍，能夠增加抗原的顯示數量（25%）和反應終產物的大小。這在研究胚胎發育過程中一些抗原含量較低的組織時，具有一定的應用價值。雙橋法可能是通過下列途徑提高其敏感性的：①重復的橋抗體與PAP復合物中的抗HRP抗體的未飽和抗原位置結合，再連結另外的PAP復合物，在抗原部位抗體間彼此結合形成較大的抗原抗體復合物，具有多個酶分子（圖4-9A），使反應增強。這可能是雙橋法敏感性增高的主要機制；②重復的橋抗體與第一抗體未飽和的抗原位置結合，使第一抗體上結合較多的橋抗體及PAP復合物（圖4-9B）。但PAP復合物較大，應設法提高其穿透性，達到增加染色強度的目的。
圖4-9 雙橋PAP法的兩種放大原理
4．半抗原夾層法（Hapten Sandwich Method） 首先用半抗原（FITC等）標記的第一抗體與組織抗原結合，繼之用HRP（或ALP）標記的抗FITC抗體與組織抗原結合的FITC的反應，呈色后觀察抗原存在部位。FITC為一種熒光色素，熒光顯微鏡下呈亮綠色熒光，所以也可以同時觀察免疫熒光染色結果。FITC特異熒光褪色后，其抗原性仍不丟失，從這種角度講，熒光抗體法的切片亦能半永久保存。該法較一般間接法敏感性高，最大優點是不管第一抗體來自何種屬，只要與FITC連結，均可被同一酶標記的抗FITC抗體識別。避免了準備不同種屬的酶標抗體的麻煩，而且FITC標記抗體技術成熟、穩定，商品種類多，容易購買，實驗者不妨一試。
第四節 ICC的幾種特殊應用
近年 ICC技術在下述方面的應用，令人注目，有著廣闊的前景。現介紹如下：
一、ICC在鋪片中應用
鋪片（Whole Mount Stretch Preparation） 是研究神經分布應用較早、較廣的方法。19世紀末，Dogiel和Cajal等利用鋪片技術，結合鍍銀及甲基藍染色，觀察腸道神經叢模式、神經元種類及其相關聯的間質細胞。近年來，人們進一步認識到全層鋪片技術的優點：例如①不必采用連續切片和三維重建技術，可以直接觀察神經元間質細胞的三維結構；②能觀察較大區域，在研究顯微外科手術后神經分布模式和數量改變中有較好的應用價值；③操作簡單，能在較短時間內制作大量標本等。所以，鋪片技術在ICC染色中得到廣泛的采用（Zhou等1992）
鋪片ICC染色方法與切片基本相同，所不同的是鋪片較厚，背景著色較強，有時甚至妨礙特異性染色的觀察。實驗證明，這種非特異性染色主要是酶標抗體/橋抗體與組織γ-球蛋白結合引起的，用封閉性阻斷劑及正常血清等分別孵育切片，并