第二十九期質譜沙龍活動報道

　　2010年11月6日下午，第二十九期質譜沙龍活動在北京大學人民醫院（北京大學第二臨床醫院）舉行。來自解放軍第二炮兵總醫院、北京大學人民醫院、AB SCIEX公司、天津博納艾杰爾科技有限公司、北京艾米諾醫學研究有限公司等三十余位專家、學者、技術工程師等參加了本次沙龍活動。

第二十九期質譜沙龍活動現場

液相色譜-質譜分析中的基質效應及其解決方案

　　北京大學人民醫院趙立波博士作了題為《液相色譜-質譜分析中的基質效應及其解決方案》的報告，主要介紹了介紹了液相色譜一質譜(LC—MS)分析中基質效應的產生機制、來源、評定方法和消除措施。

北京大學人民醫院 趙立波 博士

　　基質效應的產生機制

　　LC～MS／MS中的基質效應由分析物的共流出組分影響電噴霧接口的離子化效率所致，表現為離子增強或抑制作用。基質效應由形成帶電霧滴時非揮發性的基質組分與分析物離子競爭產生，這些非揮發性基質組分將霧滴牢牢吸在一起，阻止其分裂成更小的微滴。根據接口處離子化和離子蒸發過程中的變化情況，這種競爭可能妨礙(離子抑制)或增強(離子增強)所分析目標物離子的形成效能，亦即分析目標物離子的形成效能與進入電噴霧源的基質密切相關。

　　基質效應的來源

　　基質效應主要來源于生物樣品的內源性組分。內源性組分是指生物樣品中存在的有機和無機成分，經前處理后仍存在于提取液中。包括離子顆粒物成分(電解質、鹽類)、強極性化合物(酚類、色素)和各種有機化合物(糖類、胺類、尿素、脂類、肽類及其分析目標物的同類物及其代謝物)。其中磷脂是最主要的內源性組分，其對電噴霧電離(ESI)和大氣壓化學電離(APCI)均會產生離子抑制作用，具有表面活性的甘油磷脂酰膽堿是最強的內源性組分 。

　　外源性組分在生物樣品中不存在，但同樣會帶來基質效應，其由樣品前處理過程引入，包括塑料和聚合物的殘留、鄰苯二甲酸鹽、清潔劑(烷基酚)、離子對試劑、有機酸、緩沖液、SPE柱材料、流動相等。另外，APCI離子化方式比ESI對基質效應更敏感。基質效應不但與離子化方式有關，而且與各個儀器廠家的源設計也有關。

　　基質效應的評定

　　通過評定基質對分析物信號的影響程度，可大致將基質效應的評定歸結為2種方法：柱后注射法和提取后添加法。柱后注射法屬于動態方法，注射泵和接色譜柱的液相系統通過三通接頭與質譜連接。注射泵恒流注射一定濃度的分析物；生物樣品不添加分析物，提取后按已定的色譜條件進樣，記錄分析物的響應，此方法可考察整個色譜循環的基質影響。提取后添加法是采用提取后添加法建立數學模型評定基質效應在LC—MS／MS中使用的最多，而且，此法可同時考察提取回收率。

　　基質效應的消除

　　LC—MS分析時的基質效應客觀存在，并隨生物樣品的不同而不同。趙博士介紹了四種基質效應消除的方法——樣品前處理、同位素內標、更換離子源和調整流動相，重點講解了前兩種。

　　 樣品前處理

　　改進前處理方法、純化樣品、盡可能地減少最終提取液中的基質成分是最有效、徹底地消除基質效應的方法 生物樣品的前處理方法很多，研究普遍認為利用有機溶劑蛋白質沉淀法或稀釋法處理的樣品，其基質效應明顯高于SPE或LLE方法。

　　通過基質效應評定的方法，可系統檢查基質效應產生的環節。例如，尿液中的肌酸酐或木脂素可較強抑制激素類分析，應通過前處理過程去除。在樣品進樣前進行稀釋也可降低其基質效應，但此法在超痕量分析時不適用。盡管樣品前處理過程繁瑣，但樣品純化仍是最佳的基質效應消除方法

　　同位素內標

　　同位素內標不但可抵消質譜離子化時的基質效應，還可消除樣品前處理過程中的差異。但同位素內標購置困難，且在多個分析物同時檢測時，由于存在極性差異，即使是同類物的同位素內標也很難抵消基質效應，造成定量結果偏差：例如，采用原體藥物的同位素內標同時分析某藥物及其葡萄糖苷結合物，則該內標無法抵消極性較強的葡萄糖苷結合物的質譜離子化變化。

液相色譜梯度方法的開發及其在質譜定量技術中的應用

　　解放軍第二炮兵總醫院李鵬飛老師作了題為《液相色譜梯度方法的開發及其在質譜定量技術中的應用》的報告，主要介紹了梯度洗脫的特點、方式、步驟和開發。

解放軍第二炮兵總醫院 李鵬飛 老師

　　梯度洗脫基本知識

　　梯度性地改變洗脫液的組分(成分、離子強度等)或pH，以期將層析柱上不同的組分洗脫出來的方法，在同一個分析周期中，按一定程度不斷改變流動相的濃度配比，稱為梯度洗脫。從而可以使一個復雜樣品中的性質差異較大的組分能按各自適宜的容量因子k達到良好的分離目的。

　　梯度洗脫的優點是：單位時間的分離能力增加，檢測靈敏度提高，使樣品與溶劑前沿基線分離，降低基質干擾；缺點是：儀器設備要求高，不適合某些檢測方式，柱需再生-增加分析時間，基線漂移。提高柱效改善檢測器的靈敏度當樣品中的一個峰的k'值和最后一個峰的k'值相差幾十倍至幾百倍時，使用梯度洗脫效果特別好。梯度洗脫中為保證流速的穩定，必須使用恒流泵，否則難獲重復結果。梯度洗脫常用一個弱極性的溶劑A和一個強極性的溶劑B。

　　梯度洗脫步驟

　　梯度洗脫的一般步驟是：1）選擇兩種合適的溶劑A和B。2）進行初步分離。3）在接近tO處如果譜帶擠在一起，則應降低初始溶劑A的強度，若譜帶遠離色譜圖的開始部分，則應增大A的強度；如果需要洗脫很長時間，則應增加溶劑B的強度；如果所有的譜帶都在比較靠前的位置被洗脫，則應降低B的強度。4）如有必要可以調節斜率；為增大靈敏度可以增加斜率，為增大分離度，可以降低斜率。5）必要時為提高選擇性可改變溶劑B。6）解決具體問題，比如溶劑分層，沒有有效的弱溶劑A時，可以用梯度延遲來解決譜圖前部分分離不良的問題。

　　梯度洗脫平衡時間大于8～9分鐘，平衡即充足，有機污染物影響梯度分析，如“三蒸水”有大量有機污染物不適合做梯度分析。

　　梯度方法開發實例

　　第一步，開發一個有9個烷基苯酮化合物的梯度方法，用C18柱，在最初的條件下（0-100%，水-乙腈），分離不理想。整個色譜峰組保留時間太長，分離度葉不好。

　　第二步，為使色譜峰前移，提高起始時乙腈的比例（50-100%，水-乙腈），分離得到改善。但是9個化合物出了10個色譜峰，說明有雜質存在，很可能是流動相水中的。

　　第三步，從空白梯度圖顯示，在同樣的色譜條件，同樣的檢測靈敏度下，共有兩個雜質峰。說明流動相水中的雜質在此條件下可能會對檢測有影響。

　　第四步，空白梯度圖同樣品的色譜圖進行對照后，我們看到雜質（共兩個峰）中的第一個小峰對第8個色譜峰有干擾，會使其定量分析結果不準確。

　　第五步，根據“梯度曲線下的面積越大，洗脫能力越強”的規律，試用#5曲線使3-9號峰提前（曲線5，50-100%B），但是小峰仍沒有分出來。

　　第六步， 根據“梯度曲線下的面積越大，洗脫能力越強”的規律，試用#5曲線使3-9號峰提前，改用50-95%B見到好的現象。

　　第七步，最后用50-95%B，得到好的結果。

　　梯度方法開發首先要明確目標，如整個色譜峰組保留時間太長，分離度也不好，雜質分離等；然后對癥下藥，如為使色譜峰前移，提高起始乙腈的比例，分離得到改善。

　　最后，李老師又介紹了其它幾種梯度形式并用趙老師的話總結了選擇梯度的原因：不管是作單一的還是多個化合物的分析，液質聯用盡量用梯度洗脫，以來可以使質譜峰形更窄，靈敏度更高；更重要的是可以降低成本，比如對一根新色譜柱，走等度可走1000針，而梯度可以到2000針；梯度方法里，柱子被清洗得更干凈。

Triple TOF 5600 在生物標志物發現中的應用

　　郭立海博士作了題為《Triple TOF 5600 在生物標志物發現中的應用》的報告，主要介紹了蛋白質組發展趨勢及其對質譜技術的要求，Triple TOF 5600分析蛋白質的三種應用，Triple TOF 5600獨特的設計支持了同時定性定量等內容。

AB SCIEX公司 郭立海 博士

　　蛋白質組發展趨勢及其對質譜技術的要求

　　郭博士首先描述了蛋白質組概念，并和基因組作了簡單比較。接著郭博士對發現、靶向蛋白質組和定性、定量蛋白質組的概念進行了形象地解釋并從中闡述了蛋白質組的發展趨勢。

　　發現蛋白質組（Discovery Proteomics）類似于撒網捕魚策略，優點是快速、大規模、高通量，能得到大量數據和信息；缺點是數據太多，數據后期處理比較麻煩，大量的數據中有意義的數據少，不一定能得到直接感興趣的數據。這是傳統蛋白質組學。靶向蛋白質組（Targeted Proteomics）的靶向性和目的性都很強，類似于采用特異性強的誘餌，有目的性的同時在多個區域大規模放置釣竿，釣得研究者真正感興趣的、最有研究潛力的魚，撇開其它的干擾，從而加速針對性強的研究。這是最近兩年才興起的新的蛋白質組學方向。

　　定性蛋白質組（Qualitative Proteomics）就是解析蛋白質的一級結構信息，包括這個蛋白質的氨基酸序列是什么，發生了怎樣的結構變化或翻譯后修飾等，比如蛋白質表達譜、修飾譜等。定性蛋白質組是蛋白質組研究的基礎，起步的蛋白質組主要是鑒定生物樣品里都含有什么蛋白質，現在依然很重要，因為生物體里還有大量的蛋白質并未被鑒定，大量的修飾信息還未被覆蓋。定量蛋白質組（Quantitative Proteomics），靶除了知道是什么蛋白或發生了怎樣的修飾外，還要給出量的信息，這是后蛋白質組時代的要求。因為蛋白質組是動態的，研究在某種特定條件下蛋白質量的變化才有可能揭示真正的生物學問題，況且生物標志物本身就是靠定量來發現的，這是現在蛋白質組研究的重中之重。尤其是近幾年來各種同位素標記方法（iTRAQ試劑）和串聯四極桿特定的定量方法-MRM應用在蛋白質研究中，更是推動了定量蛋白質組的蓬勃發展。

　　定性、定量蛋白質組研究對質譜技術提出了很高的要求，定性方面要求質譜儀器靈敏度高、速度快、準確度和分辨率高；定量方面首先要求定性，同時要定量動態范圍寬、 定量準確度高、穩定性和選擇性好。AB SCIEX公司推出的Triple TOF 5600可以實現漂亮的定性，同時兼做定量。高分辨率、高質量準確度、高靈敏度、高采集度和高定量線性動態范圍，在MS和MS/MS，在定性和定量，總是同時達到。

　　Triple TOF 5600分析蛋白質的三種應用

　　接下來，郭博士重點講述了Triple TOF 5600 在蛋白質組分析方面三種應用模式（技術路線）。

　　IDA定性

　　IDA是純定性的，目的是鑒定更多的蛋白質。IDA工作模式是先進行色譜分離，然后進行質譜掃描，一級掃描結束后要快速進行二級掃描，這樣才能鑒定出更多的蛋白質。同時，一級掃描和二級掃描全部是高分辨的，能把更多的峰區別開來，從而鑒別蛋白質的數量也就增多。接著，郭博士舉了酵母細胞裂解物實驗以及大腸桿菌和植物蛋白等檢測的例子，均證實Triple TOF 5600表現出很好的效果。

　　定性定量，label free

　　定性定量兼做實際上是做蛋白質組的時候做非標記定量。比如說兩組蛋白——一組是疾病樣，一組是正常的，然后進樣比較鑒定蛋白質，根據峰面積看哪些蛋白質發生了變化。它的工作模式也是先進行色譜分離，然后進行一級掃描，一級峰面積是用來定量的，可以計算肽的相對量是多少。一級掃描速度要慢，從而得到更多的數據點，同時分辨率也會更好一點。因為是高分辨率，所以提取峰的窗口可以縮到很小，達到消除干擾，提高特異性的目的。隨后有很多的二級掃描，速度比較快，這主要是來定性的。接著，郭博士舉了人體蛋白酶酸化肽的例子。

　　高分辨MSMS定量（MRMHR）

　　高分辨MSMS定量與MRM有所不同，它在方法中要指定母離子，消除背景干擾，定量更準確，而沒有指定碎片離子。打入幾十或幾百個母離子去掃描，就能得到所有母離子碎片，相當于不做一級掃描，直接進行母離子碎片二級掃描。由于掃描速度快，能夠對所有母離子碎片進行全掃描，而不是特異掃描，然后從中截取三個較好的響應值疊加到一起，消除定量差異性。高分辨對定量的好處是能夠進一步縮小截取的窗口，消除干擾，提高選擇性。接著，郭博士舉了一個血漿樣品中蛋白質分析的例子。

　　Triple TOF 5600獨特的設計支持了同時定性定量

　　Triple TOF 5600是第一臺集高準確質量數、高分辨、高掃描速率和高定量靈敏度為一體的系統，一次進樣就可完成復雜樣品中低含量化合物的定性確認和定量分析，能非常方便地從定性工作流程（如定性確認、篩查）轉化為定量分析。那么，Triple TOF 5600到底有哪些獨特的設計，同時實現了定性定量？

AB SCIEX Triple TOF? 5600

　　AB SCIEX Triple TOF? 5600系統特點為：

• 高靈敏度，在全掃描和二級質譜掃描方式，靈敏度達到業界高端QQQ質譜的MRM水平；

• SmartSpeed? 100Hz采集速率，每秒可完成100次MS/MS 或MS掃描；

• 高分辨率，在任意掃描速度下質譜分辨率都可達到40000；在低質量端m/z 100左右，也可達到30,000以上的分辨率；

• EasyMass? 準確度，質量準確度小于1ppm(RMS)；

• 線性動態范圍，可達5個數量級；

• 系統非常可靠，用外標法，質量誤差長期可以保持在~1ppm。

　　與儀器配合使用的還有用于快速簡便地處理/顯示大量質譜數據的峰觀測(PeakView?)軟件，用于簡化小分子和大分子定量流程的多組分定量(MultiQuant?)軟件，用于簡化蛋白質組學研究的蛋白導航(ProteinPilot?)軟件等。AB SCIEX Triple TOF? 5600系統在高級飛行管、光學聚焦技術、真空系統等硬件方面也有重大改進。TripleTOF 5600系統為生命科學家在復雜樣品的全面分析、快速篩選和高分辨定量等方面提供了強大的、新的工作流程，這些性能是在其它類型的質譜中不可能獲得的。

　　本網收錄：TripleTOF? 5600質譜系統

血漿樣品的快速處理方法

　　天津博納艾杰爾科技有限公司韓勇技術工程師作了題為《血漿樣品的快速處理方法》的報告，主要介紹了天津博納艾杰爾科技最新的三款產品——蛋白沉淀板、SLE和MAS及其應用和各方法比較。

天津博納艾杰爾科技有限公司 韓勇 技術工程師

　　蛋白沉淀板

　　傳統的蛋白沉淀法的缺點：繁雜的加樣、渦旋、離心、轉移等操作，可能造成藥物損失；不是一種高通量的方法；不適用于自動化的儀器。Cleanert蛋白沉淀產品有兩種產品形式。在方法開發時可以使用柱形管式，在處理實際樣品時可以使用96孔板形式。疏水性篩板具有阻擋以水為主要成分血漿的下滲，阻擋變性蛋白，乙腈、甲醇等有機試劑易于通過等性質。蛋白沉淀板的優點是：獲得更潔凈的樣品，操作簡便快速、減少樣品損失，是一種高通量的樣品處理方法，與自動化萃取儀器兼容，傳統蛋白沉淀方法的簡單移植。

　　SLE

　　液液萃取法的缺點：繁雜的加樣、渦旋、離心、轉移等操作，可能造成藥物損失；產生乳化現象；不是一種高通量的方法；不適用于自動化的儀器。SLE采用特殊工藝處理的硅藻土為填料，此填料具有較大的比表面積和較低的表面活性，能夠提供一個理想的液液分配的支撐表面。SLE 的操作方法：血漿樣品上樣，樣品在硅藻土表面形成一層薄薄的液膜；靜置5分鐘；加入適量的洗脫溶劑洗脫，重力洗脫，洗脫溶劑包裹在樣品層外部，兩液膜間進行微觀的液液萃取。SLE的優點是簡便快速、是一種高通量的樣品處理方法，避免液液萃取容易產生的乳化現象，與自動化萃取儀器兼容，液液萃取方法的移植。

　　MAS

　　固相萃取法的缺點：方法建立較為復雜，為了獲得良好的回收率和凈化效果，常常需要調節上樣的pH值以及淋洗液和洗脫液的強度；操作仍較為復雜、耗時；對極性較強的藥物效果不好。MAS（Multi-function Impurity Adsorption SPE），即“多重機制雜質吸附萃取凈化法”，該方法主要利用多官能化的復合吸附材料，以離子交換、反相、氫鍵等機理去除生物樣品中的主要內源性干擾物質，同時將目標藥物留在樣品溶液中，從而達到凈化的目的。疏水性的篩板可以阻擋以水為主的血漿和變形的蛋白，而乙腈等有機試劑易于通過，填料吸附雜質而不吸附藥物。MAS的操作方法：乙腈活化，負壓或正壓抽干；血漿樣品上樣；快速加入乙腈洗脫，同步完成蛋白沉淀與藥物提取；加正壓或負壓，收集洗脫液，進行后處理或直接檢測。MAS的優點是：操作簡便、快速、是一種高通量的前處理方法，較好的除磷脂效果，極好的平行性，適用于強極性藥物，與自動化萃取儀器兼容。

　　最后，韓工介紹了血漿中氫氯噻嗪蛋白沉淀方法的建立，血漿中托特羅定SLE方法的建立，血漿中托特羅定MAS方法的建立；血漿中普萘洛爾MAS方法與蛋白沉淀法的比較，血漿中地塞米松蛋白沉淀法、SLE法和MAS法檢測結果比較等。