冷凍電鏡：一次又一次的分辨率突破

　　過去兩年對于冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）而言，是讓人興奮的，甚至可以說是革命性的。到2014年底，兩個3.2 ?分辨率的結構通過這種方法確定：一個是β半乳糖苷酶，另一個是酵母線粒體核糖體的大亞基。

　　冷凍電鏡達到3 ?的分辨率，這本身就是一個很大的成就，標志著結構生物學進入新時代。那些一直在用X射線晶體學來實現原子分辨率的研究人員也開始涌向冷凍電鏡，試圖以此來分析那些不適合結晶的分子。

　　不過，科學界認為還需要一些大的技術進步才能突破3 ?。這個分辨率對藥物設計而言很有意義，因為這樣才能觀察水分子、鹽橋和氫鍵。

　　大約一年前，斯克里普斯研究所的Bridget Carragher和Clint Potter正在研究700-kDa的嗜酸熱原體（Thermoplasma acidophilum）的20S蛋白酶體，這個酶對細胞中錯誤折疊或過量蛋白的去除很重要。他們開始著手研究是否有分辨率的極限。

　　Carragher、Potter及其團隊花時間來優化他們的儀器，讓一切都“恰到好處”。他們采用了一種比較慢的操作，但絕不會損失分辨率。當然，科學家們用了頂級的設備：FEI的Titan Krios顯微鏡，配備Gatan的K2 Summit檢測器。

　　他們是最早突破3 ?極限的研究團隊之一，在今年3月以2.8 ?的分辨率解析了蛋白酶體的結構。幾乎同時，德國馬克斯-普朗克生物物理化學研究所的研究人員以2.65-2.9 ?分辨率，確定了大腸桿菌70S核糖體與延伸因子Tu所形成的復合物的結構，而加州大學洛杉磯分校（UCLA）的Hong Zhou團隊以2.9 ?的分辨率解析了炭疽保護性抗原孔的結構。

　　挑戰在哪里

　　在單粒子冷凍電鏡中，蛋白懸浮液在液氮溫度下冷凍，并在電子顯微鏡中以高分辨率成像。這種方法已經存在了 30多年，它有望分辨那些較大的結構，而分辨率與X射線結晶學相當。盡管冷凍電鏡有不需要結晶的好處，但它的主要挑戰是，生物標本只能忍受低的電子劑量，一旦高了，就會降解。直到幾年前，通過傳統檢測方法（CCD照相機）獲得的最佳分辨率仍然是10-15 ?。

　　“這就像在晚上照相，而不使用閃光燈，”霍華德?休斯醫學研究所的研究人員Eva Nogales談道。“我們的處理方式是收集同一對象的許許多多圖像。”然而，噪聲圖像很難對齊。

　　這一切都隨著新的直接檢測技術而改變，這種技術直接檢測電子，而不是將它們轉換成光，再轉換回電子。這種檢測器的噪聲更小，速度更快，讓研究人員能夠收集足夠的幀數，從而制作出小視頻。這樣，人們也能夠校正因電子與標本的相互作用而引起的微小動作。

　　結果是產生了更多的圖片。更多的數據意味著更大的計算負擔，但軟件工具也在同步開發。因此，據Nogales介紹，利用直接檢測器，圖像質量比之前使用CCD照相機好了100倍。過去需要幾年才能完成的工作，如今在理想的情況下，可在一兩天內完成。

　　有了如此高級的工具箱，研究人員能夠在短時間內突破3 ?的分辨率極限。

　　去年，美國國家癌癥研究所的Sriram Subramaniam及其團隊以3.2 ?的分辨率解析了β半乳糖苷酶之后，他們并不滿足。“我們做了許多標本，但沒有真正的方法去評估哪個是好的，哪個不是，”他說。于是他們搜尋了多個標本，發現偶爾能接近2.5 ?。

　　最困難的部分在于發現哪里需要改變。儀器是相同的，而標本制備、成像和數據處理經過了改進。研究小組最終采集了最好的數據，并系統地評價了哪一部分的數據最有用。這項成果于5月發表在《Science》雜志上，達到了冷凍電鏡目前最高的分辨率：2.2 ?。（延伸閱讀：Science：革命性技術獲得新突破）

　　未來在何方

　　如今，結構生物學家正在購進新的顯微鏡或增加他們已經擁有的。作為紐約結構生物學中心Simons電鏡中心的管理者，Carragher和Potter迎來了一臺新的Krios。他們希望它能夠在今年年底之前開始運行。普渡大學的電鏡中心也剛剛收到了一個新的K2 Summit直接電子檢測器，用于他們的Titan Krios顯微鏡。

　　在購買K2之前，普渡大學Michael Rossmann實驗室的博士后研究員Lei Sun花了大量的時間，試圖利用結晶學獲得噬菌體T4門戶蛋白的結構，這個蛋白對基因組包裝和啟動衣殼組裝很重要。她所能獲得的最佳分辨率是6.5 ?。

　　在使用了UCLA的直接檢測器之后，Sun能夠獲得團隊所需的數據 – 3.6 ?分辨率的結構。她們的工作發表在7月的《Nature Communications》上，揭示了這個蛋白為什么難以結晶：它有著可變數量的分子結構單元。盡管人們認為復合物有12個亞基，但一些有11個，而另一些有13個。

　　有了新的檢測器，Rossmann計劃要做的第一件事就是確定腸道病毒D68（EV-D68）最新分離株的結構。這個病毒在去年導致美國數千名兒童患上呼吸系統疾病。今年1月，他的研究小組解析了EV-D68之前的分離株與pleconaril（一種抗鼻病毒藥物）結合的晶體結構。由于EV-D68難以結晶，研究小組希望冷凍電鏡能帶來好運氣。

　　不過，冷凍電鏡在技術上仍具有挑戰性，而實現高分辨率的技術仍掌握在少數科學家的手中。“我們現在看到的許多結構其實已經研究了很多年，”馬克斯-普朗克生物物理研究所的結構生物學家Werner Kühlbrandt談道。在這些長期的項目中，人們一直在辛勤而艱難地純化和穩定分子，對于它們而言，冷凍電鏡的時機已經成熟。不過，越來越多的項目將要解析不太熟悉的結構，因此可能還需要優化。

　　更重要的是，目前已解析的結構都是大的、剛性的，在大多數情況下是對稱的。與此相反，膜蛋白復合物以及與藥物設計有關的其他大分子復合物都是靈活的。

　　即使是人們熟悉的β半乳糖苷酶，冷凍電鏡的操作也不是太精細，Subramaniam說。他的研究小組希望將重點放在樣品制備上，而將分辨率再推進一步。他們也想了解新方法的哪些方面將更普遍適用。“我們需要了解不同的蛋白質如何表現得更好，才能推廣這個，”他說。

　　當然，樂觀的精神也很重要。“我們現在終于解決了這個問題（突破3 ?分辨率），夢想成真，”Kühlbrandt談道。“即使在2年前，也很少人會相信這個。”