《Nature Methods》盤點2015年度技術，選出了最受關注的技術成果：單粒子低溫電子顯微鏡（cryo-EM）技術。 除此之外，也整理出了2016年最值得關注的幾項技術，分別為：細胞內蛋白標記（Protein labeling in cells）、細胞核結構（Unraveling nuclear architecture）、動態蛋白質結構（Protein structure through time）、精準光遺傳學（Precision optogenetics）、高度多重化成像（Highly multiplexed imaging）、深度學習（Deep learning）、亞細胞結構圖譜（Subcellular maps）和綜合單細胞圖譜（Integrated single-cell profiles）。
新蛋白標記
熒光化學染料相對較小，具有很好的光物理性質和光譜跨度。這些特性使熒光染料特別有吸引力，有望替代熒光蛋白進行蛋白標記。研究者們正在積極開發相應的工具，在活細胞中用染料標記目的蛋白。
對于絕大多數應用來說，熒光染料需要能夠實現特異性的標記。現在已經有一些工具能做到這一點，比如SNAP和Halo標簽、FlAsH和ReAsH、和hexahistidine標簽。這些工具主要使用能特異性結合相應染料的小蛋白或多肽，對靶蛋白進行標記。還有一種方法是在蛋白翻譯過程中摻入非天然氨基酸，這些非天然氨基酸本身就發熒光，或者可以通過點擊化學（click chemistry）發出熒光。
雖然這些方法越來越受歡迎，但它們也遇到了一些問題。舉例來說，熒光染料在多重成像中用處有限，能跨越活細胞膜的染料標記效率低、數量少、質量差。這類染料的開發目前是一個相當活躍的研究領域。毫無疑問，未來人們將大大增強熒光染料的標記效率，這會進一步提高定量成像的能力。可用染料將得到顯著改進，這會增加多重化，減少成像所需的光。全新的蛋白標記方法也將出現在人們眼前。
特異性蛋白標記有助于在固定細胞和活細胞中進行超高分辨率成像。當分辨率接近幾十納米的時候，標記造成的問題就會凸現出來。舉例來說，用抗體進行標記會使目標結構增加約10nm，而二抗會進一步增大檢測目標。為了解決這一問題，不少研究者正在開發納米抗體（nanobodies）。納米抗體是來自駱駝的小抗體片段，是人們用基因工程方法克隆駱駝重鏈抗體可變區得到的單域抗體。與傳統IgG抗體相比，納米抗體具有分子質量小、容易生產、穩定性好、抗原結合力高等特點。
我們相信，新的一年會有更多更好的蛋白標記策略涌現出來，讓顯微成像登上一個新的臺階。
細胞核結構
“位置高于一切”是房地產的金科玉律，這句話也同樣適應于哺乳動物基因組。基因調控依賴于染色質及其調控元件在細胞核內的三維組織形式。染色質構象捕獲的經典方法（3C），讓我們對染色質的復雜結構有了驚鴻一瞥。但要在高分辨率和高通量水平上成像3D染色質結構的動態，我們還需要新的方法。這些方法將幫助我們真正理解基因組的組織形式，這種形式隨時間推移的演化，及其對疾病的推動作用。
3C衍生技術主要是將相互作用的染色質位點交聯起來，然后再進行擴增和測序。這種技術的通量受到了限制，而且對順式互作有偏好。最新的技術改良包括兩個連續的捕獲步驟，不僅大大提高了通量和分辨率，還能實現弱互作和強互作的相對定量，闡明它們各自的生物學作用。（Nat. Methods 13, 74–80, 2016）
要想全面把握細胞核結構的動態，把群體數據與單細胞數據結合起來是很重要的。這就需要覆蓋基因組學、生物物理學和顯微成像的綜合性方法。美國NIH最近資助的4D細胞核組學計劃（4D Nucleome Program）就是一種這樣的嘗試，該計劃希望結合多方面力量獲得基因組結構圖譜，在高分辨率水平上成像和研究亞細胞核區域。研究者們正在進一步改良實驗和計算方法，以適應單細胞的核組分析。
一旦細胞核結構分析成為更為常規的定量程序，我們將能更好的預測突變（不論是與疾病有關的突變還是在基因組編輯時引入的突變）對基因調控的影響，以及突變的作用機制。我們甚至能特異性改變基因組結構，給細胞帶來我們想要的改變。
動態蛋白質結構
動態蛋白質結構（Protein structure through time）分析技術主要指的就是時間分辨晶體學技術（time-resolved crystallography），這種技術在2014與2015年間多次出現在Nature，Science兩大頂級期刊中，取得了許多重要的進展，令科學家們可以觀察到快速蛋白結構的變化。
蛋白靜態結構能幫助生物學家了解其功能，但研究人員還希望能觀察到蛋白的動態變化，然而要想檢測瞬時中間構象并不是件容易的事。
分析蛋白質動態變化可以采用的一種方法：時間分辨X射線晶體技術 (TRX)。這種方法利用激光“泵”脈沖啟動一個反應，然后X射線“探測”到脈沖，收集一系列隨著反應發生的衍射圖樣。
過去要完成這樣的實驗需要非常專業化的激光同步源，而且這些設備存在“限速”——約100 皮秒。現在近期技術進展能通過超快X 射線自由電子激光 (XFELs)，來提供飛秒級的時間分辨率，允許研究人員觀察非常迅速的結構變化。
2014年，亞利桑那州立大學等處的研究人員就利用SLAC國家加速器實驗室世界上最強大的X射線燈，獲得了光系統II(photosystem II)將水分解為氫和氧時這一分子復合體的第一批成像圖片。這一研究成果公布在Nature雜志上。
利用直線加速器相干光源LCLS（Linac Coherent Light Source），研究人員監測了光系統II復合體分子結構的改變，分辨率達到5.5?。LCLS只提供30飛秒的照射時間，短到可以在不同的階段定格水分解過程。
之后另外一組研究人員用X射線激光器以慢動作的形式展示了一個光敏性生物分子的快速動態。研究成果公布在Science雜志上。
研究人員將PYP蛋白（photoactive yellow protein）作為模式系統，PYP是一種藍光感受蛋白，在特定細菌的光合作用中起作用。PYP蛋白捕獲藍光光子之后，會經過一系列中間結構獲得光子的能量，然后再回到初始狀態。PYP光循環的絕大多數步驟已經被人們研究過了，是驗證新方法的理想模型。為了獲得PYP的動態快照，研究人員制造了微小的PYP晶體，這些晶體的直徑大多小于0.01毫米。他們在LCLS（目前最強的X射線激光器）系統中噴射這些微晶體，并用精確同步的藍光脈沖啟動它們的光循環。LCLS生成了極短極密集的X射線快照，捕捉到了PYP在光循環不同階段的形態改變，分辨率達到了前所未有的0.16納米。隨后研究人員將自己獲得的快照組成視頻，展示了慢動作的PYP光循環。
同年，來自英國利茲大學的研究人員詳細描繪了這種技術，他們指出這種新方法采用了clever maths（一種Hadamard轉換），幫助科學家們利用強大的同步輻射光進行結晶或其它技術，從而完成時間分辨晶體學研究。
2015年同樣發表在Science雜志上的一篇文章中，一組研究人員又利用超快XFEL脈沖，解析了肌紅蛋白鐵離子光解活性部位血紅素二氧化碳鍵的結構變化。
未來一定還會有越來越的相關成果，我們期待這一技術在2016年的發展。
精準光遺傳學
時間往回撥五年，2010年Nature Methods的年度技術就是光遺傳學（optogenetic）。光遺傳學是由斯坦福大學的研究人員開始用于研究小鼠大腦的，他們將這項技術稱之為Optogenetics(optical stimulation plus genetic engineering 光刺激基因工程/光遺傳學)。經過這么幾年的發展，光遺傳學已經在細胞分辨率水平上實現了對神經元的操控，從而為實現神經微解剖走出了第一步。
在十年前光敏感通道ChR2（Channelrhodopsin-2）就被引入了神經生物學領域，這種強大的工具經證明不僅能用于刺激神經元，而且也能用作其它光遺傳學工具。這些工具用途廣泛，尤其適用于遺傳定義神經元的表達，但科學家們需要的是更加詳細的神經回路信息，因此還需進一步探索模式照明方式，操控神經元亞群活性。
幾種方法能獲得光照模式，比如快速掃描鏡（fast scanning mirrors，生物通譯），計算機生成全息模式都能作為空間光調制器。此外，照明方式也需要與神經元活性光學輸出組合起來，但這并不容易，由于要求光遺傳激活劑與活性傳感器之間的光交流，因此需要多重優化。
近年來也取得了一些成果，如發表在Nature Neuroscience雜志上的一項研究表明，通過雙光子激光，快速掃描鏡對不同神經元進行歸總和開啟，可以實現接近同時的神經元照明。
還有來自倫敦大學學院的研究團隊使用兩種尖端技術發現了解大腦是如何工作的新途徑，他們為了能夠讀出神經細胞的活動，基因編碼神經細胞傳感器使得其在激活時就能發光。同時為了能夠控制神經細胞的活動，研究人員在這些神經細胞設計表達光敏蛋白，使得其能被光閃激活。
重要的是，這篇文章找到了一種方法可以同時激活多個腦細胞：通過全息技術，研究人員把一束光分成更小的子光束從而選擇性靶向單個腦細胞。
在這兩項研究中都采用了一種紅移峰（red-shifted，生物通譯）光遺傳執行元件：C1V1減少綠色鈣離子指示劑（報告神經活性）之間的光交流。此外，在無行為動物中，纖維內窺鏡（fiberscopes）也可以通過傳遞單光子照明實現相同的模式。
細胞分辨率水平的光遺傳學未來將能促進我們對多種神經元亞群分類和功能的了解，不過這些方法迄今為止只能在單一二維平面上刺激神經元，而神經元實際上是在大腦三維環境中進行交流和完成功能的。將光遺傳學擴展在三維空間，也許就能打開神經元功能研究的另一扇大門。
高多重成像
熒光團之間的光譜重疊，是成像復雜生物學結構的一個主要障礙。這種限制讓絕大多數實驗只能檢測三、四個靶標。我們怎樣才能看到一個多彩的細胞呢？多重成像可以做到這一點。多重成像能在更有意義的環境中觀察分子，更好地分析多成分復合物的形成和改變。這種技術終將轉變我們對生物學過程的理解。
為了解決多重成像目前面臨的問題，人們正在開發更好的探針。比如跨越可見光區和不可見光區的探針，這些探針可以帶來更多的顏色選擇。還有一種稱為intracellular laser的探針，它們的光譜很窄，比較容易區分開。這些探針方面的改進，有助于用標準顯微鏡實現更好的多重成像。
此外，研究者們還在開發光學裝置來檢測光譜重疊的熒光團。舉例來說，華人學者Ke Xu及其同事搭建了SR-STORM顯微鏡（spectrally resolved stochastic optical reconstruction microscopy），通過真彩超高分辨率顯微成像獲得每個標簽分子的光譜和位置信息。這一方法能夠輕松辨別光譜高度重疊的熒光團，為人們打開了多靶標成像的大門。
高度多重的免疫熒光成像技術也在不斷涌現。研究者們先用抗體標記一組靶標，并且進行成像。然后漂白或剝除探針，再以同樣的方式標記不同靶標。反復多輪標記之后就能建立起高多重圖像。華裔學者蔡龍通過這樣的策略完成了高多重轉錄組成像，在多輪成像之后利用獨特條碼鑒定不同的轉錄本。
莊小威實驗室開發的單分子成像技術MERFISH（multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization），是一種高度多重化的smFISH成像方法，可以在單個細胞中鑒定數千種RNA的拷貝數和空間定位，打破了之前的技術局限。
雖然上文提到的方法都很強大，但活細胞多重成像仍然需要方法改良。活細胞與固定細胞的多重成像有相同的問題，但也面臨著一些特別的挑戰。舉例來說，活細胞可用的熒光染料和探針比較少，需要快速圖像獲取，而且對光照敏感。
相信在不久的將來，人們會開發出大規模多重成像的實用策略，進一步探索細胞中發生的生物學過程。
基因組分析深度學習
功能強大的機器學習能力令計算器開始解決了一些感性問題，如圖像和語音識別，而這也越來越多地被應用到了生命科學領域。這些深度學習技術，比如人工神經網絡可以利用多重處理層檢測龐大數據庫中的模式和結構。
這其中的每一層都會從構建的上一層數據中學習到一個概念，越高層，學習概念越抽象。深度學習并不取決于事先的數據處理和自動提取特征。用一個簡單例子來說明：一個任務為形狀解釋的深度神經網絡，其第一層是識別簡單的邊，然而在之后的層中增加更加復雜的形狀（由這些邊組成），有多少層并沒有什么硬性規定，但是大多數專家人物構成深度學習起碼要超過兩層。
近期一些研究展示了深度學習的作用，這種技術能單單根據DNA序列，就能衍生出基因組中的調控特征，如今年發表在Nature Methods雜志上的一篇文章指出，DeepSEA 可以輸入基因組序列，串聯出大規模項目（如ENCODE和表觀遺傳學路線等）的染色質圖譜，預測出一些重要調控位點的單核苷酸變異的影響，這些調控位點包括脫氧核糖核酸酶DNase敏感位點，轉錄因子結合位點，和組蛋白標記位點等。
另一個方法：Basset 則能利用相似的深度神經元網絡，預測單核苷酸多態性對染色質可接近性的影響；還有 DeepBind 能發現RNA與DNA上的蛋白結合位點，預測突變的影響。
深度學習能從非常龐大的數據庫中挖掘到高水平信息，因此將在大數據分析中大顯身手。特別是對于基因組分析，可以解決由于訓練數據缺失依賴性和計算成本高造成的諸如過度擬合（overfitting）等問題。學術機構，還有一些新公司（如Deep Genomics）的研究人員去年發起了一項活動，倡導利用深度學習分析基因組，其目的在于預測遺傳變異的影響——包括自然發生和由基因組編輯引起的變異，解析這對細胞調控的影響，以及由此引發的對疾病發展的影響。
蛋白定位亞細胞圖譜
早在幾個世紀之前，我們人類就開始繪制地球，海洋和天空的地圖了，然而直到近幾十年，我們才開始在分子水平上探索細胞的圖譜奧秘。
細胞結構嚴密，不只是細胞質，細胞內的各個成分均組織緊密整合。這些成分構成細胞器，具有特殊的分子組成和特性，而且它們也隨著不斷分子流入與流出，保持著動態平衡。毫無疑問，細胞功能進程依賴于其結構：細胞篩選通過一系列膜結構，許多信號過程也是通過分子支架進行組織的，還有基因表達也與基因組的空間構成有關。雖然細胞組織和蛋白定位可以通過細胞生物學解析，但是其中對蛋白分布進行系統分子繪圖依然有待研究。
早期的研究工作利用細胞分餾，進行蛋白定位生化分析，主要采用的技術是質譜（Cell 125, 187–199, 2006），而近年來科學家主要采用基于抗體的免疫細胞化學方法等技術繪制亞細胞結構圖譜，其次還有遺傳編碼工具，如抗壞血酸過氧化物酶，生物素連接酶，這些都可以用于基于接近感測（proximity-based methods）的生物素化分析方法，還有捕獲與質譜技術，也能確定細胞內靶向位點上存在哪些蛋白。
麻省理工學院的研究人員利用顯微鏡成像和質譜法，標記了細胞特異區域中的蛋白質，生成了一張該區域中所有蛋白質的綜合列表（Science 339, 1328–1331, 2013）。
他們在質譜法之前先標記活細胞中的蛋白質，從而在細胞裂解之前先獲得了空間信息。隨后在分析過程中通過注釋攜帶定位標記的蛋白，對這一信息進行重建。新系統利用了一種生物素（biotin）化學標記。為了用生物素標記蛋白質，研究人員首先設計出了一種命名為“APEX”的新酶。
該酶是一種過氧化物酶。每種過氧化物酶都具有不同的底物，生物素酚（biotin-phenol ）是APEX的一種底物。當研究人員將生物素酚添加到表達APEX的工程細胞上時，該酶生成了生物素-苯氧自由基(phenoxyl radical)——帶有不成對電子的高活性分子。這些自由基迅速抓取附近的蛋白質，用生物素對它們進行標記。
這些方法也在不斷改進中，而且也開始被應用于亞細胞結構圖譜實驗。如一些開發的定位程序，WoLF PSORT就是用于蛋白質亞細胞定位預測的PSORT II程序的一個擴展。WoLF PSORT基于分選信號、氨基酸組成和功能motifs，例如DNA結合motifs，將蛋白質氨基酸序列轉換為數值定位特征。轉換之后，一個簡單的k最近鄰居分類器被用于預測。
甚至市場上也有一些相關產品，如Life Technologies推出了即用型的熒光蛋白載體，融合了信號肽，能將表達的熒光蛋白定位到亞細胞器中，如核、質膜、內質網、高爾基體和過氧化物酶體等等。這種CellLight?試劑將信號肽或細胞結構蛋白與emGFP和TagRFP融合，可準確且特異地定位到亞細胞區室和結構。
雖然蛋白定位亞細胞圖譜能幫助科學家們獲取前所未有的成像圖片，但是蛋白只是構成細胞的幾種主要元素之一，因此利用這些圖譜并不能了解脂質和糖，不過對于目前的細胞研究來說，蛋白圖譜依然是最先需要開始探索的一塊土壤。
綜合單細胞圖譜
單細胞技術已經不再是什么新鮮事，幾乎每年Nature Methods展望技術中都會出現它的身影，這主要是由于培養基或者機體中的細胞存在多樣性，或者說是異質性，這為許多實驗分析造成了障礙，因此隨著現代生物學的發展，“平均值”這個詞已經不能滿足我們的需要了，我們要了解細胞之間的差異性。如果能綜合各種單細胞圖譜，那么就能幫助研究人員了解基因調控與基因異質作用機制。
在單細胞各種技術中，單細胞測序（single-cell sequencing）已經被越來越多的科學家當作一副新眼鏡，重新審視他們的研究，在細胞水平上分析組織能令研究人員更了解異質性，也更能直接確定細胞的身份，比如新細胞類型（通過比較分子狀態）。目前單細胞 DNA 和 RNA 測序方法正日趨成熟，還有一連串的表觀遺傳技術近期也達到了單細胞水平。也許未來我們就可以繪制同一細胞的多重圖譜了。
單個細胞RNA測序技術已經日趨成熟，可以進行大規模分析，同樣也能用作表型參照，推斷細胞的功能，確定細胞身份。目前檢測單細胞基因表達的方法包括DNA甲基化、染色質輔助功能、組蛋白修飾和染色體結構等方面。不過雖然這些成果顯著，但大多數方法得益于更好的基因組覆蓋率和更清晰的信號，還有待解決的方面包括高降噪技術、由于采樣問題出現的數據稀疏，以及生物變量（如來自細胞周期的差異，批處理影響和生化隨機性等)。
研究已經證明，從批量細胞表觀遺傳數據獲取搜集機制或因果機制都很困難。許多數據類型存在相關性，細胞群體基因表達之間存在復雜的相互作用。如果能夠了解同一個細胞的表觀遺傳特征和RNA特征，那么就能提供更加直觀的解析，如表觀遺傳狀態如何影響基因表達的機制解釋，RNA如何反饋到表觀遺傳變化的機制解釋等等。
此外，基因表達可以從理論上用作樣品中亞群的細胞分類，將單細胞RNA數據與檢測表觀特征其它分析進行比對（一個實驗中的DNA甲基化與另一個實驗中DNA的可接近性），就能識別出每個亞群中表觀特征之間的關聯，以及它們對基因表達的潛在影響了。
綜合單細胞技術對于干細胞生物學，發育與組織異質性研究都具有十分重要的意義，如果有足夠的樣品，那么這就應該可以解決表觀遺傳變化在特殊位點如何影響基因表達這個問題。