利用CRISPR篩查人類基因組“垃圾”DNA

　　在幾個研究小組正致力將CRISPR/Cas9系統應用于臨床的同時，另一些研究團隊則在利用這一工具來解決有關生物學的基礎問題。近期，荷蘭癌癥研究所遺傳學教授Reuven Agami與和同事們應用CRISPR搜尋了整個基因組中的調控增強子元件。

　　他們將Cas9核酸酶靶向了從前鑒別出的兩個轉錄因子p53與雌激素受體α(ERα)的增 強子元件——這些轉錄因子結合DNA序列遠距離調控了基因表達。在癌癥中p53和Erα頻繁發生突變及失調控。這一小組發表在1月11日《自然生物技術》 （Nature Biotechnology）雜志上的研究結果，闡明了兩種蛋白的關鍵增強子序列，證實了CRISPR在系統研究非編碼DNA序列中的實用性。

　　Fred Hutchinson癌癥研究中心的Cecilia Moens（未參與該研究）說，以往其他的兩個研究小組曾利用CRISPR構建出了可用于功能性遺傳篩查的人類細胞蛋白質編碼基因敲除文庫。但當前的研究 是第一次利用CRISPR/Cas9系統對調控元件進行了遺傳篩查。“這是一項概念證明研究。”

　　邁阿密大學醫學院的Ramin Shiekhattar（未參與該研究）說：“由于在內源性環境中，不利用報告基因分析極難評估調控元件的功能，這種基于CRISPR的方法真的有必要。”

　　許多蛋白質編碼基因突變已知促進了癌癥生長。尋找影響癌癥生長的非編碼區域突變則一直是一項挑戰。

　　Agami說：“增強子正確發揮功能對于維持健康組織至關重要，有許多跡象表明在癌癥中增強子功能失常有可能導致了支持腫瘤發生發展的基因表達改 變。我們需要一種工具來精確描繪出哪些增強子有可能在癌癥中起重要作用，因為識別腫瘤中的一種非編碼突變是這種腫瘤生長的原因還是結果是件非常難的事。”

　　Agami研究小組構建出了靶向685個基因組位點（代表了90%的p53已知增強子元件）的一個CRISPR單導向RNA文庫。除了這一單導向 RNA，用于篩查的人類細胞還表達了p53與一種可誘導癌基因Hras。誘導Hras異常表達可導致p53介導的細胞衰老。但如果研究小組利用 CRISPR敲除對p53功能至關重要的一個增強子，Hras表達能使細胞繼續無限制地生長。通過這種方式，該研究小組鑒別出了3個對p53功能極為重要 的增強子元件，其中兩個就在p21 （也稱作CDKN1A）基因的上游。顯然，p53需要結合p21基因上游這兩個位點才能充分激活細胞衰老。

　　在第二項篩查中，研究人員構建出了靶向73個Erα增強子結合位點的一個不同的單導向RNA文庫。在依賴于Erα表達實現生長的人類乳腺癌細胞系中，他們鑒別出了三個增強子序列。

　　Broad研究所遺傳干擾平臺主任David Root（未參與該研究）說：“看到這種策略起作用令人感到興奮。接下來，了解這一方法的廣泛性將會非常有用。”

　　將Erα活性必需的DNA元件進行分類后，Agami研究小組計劃在對抗雌激素治療產生耐藥的乳腺癌患者腫瘤樣本中測序這些位點。“我們想知道腫瘤樣本是否在這些增強子元件中累積了突變，這或許可以解釋腫瘤對治療產生耐藥的原因。”

　　Shiekhattar說，當前研究的一個有用的擴展點是，在特定情況下——如在發育的一些精確時間點及特異腫瘤類型中檢測活化的增強子。“我們無法用組織培養物完全重演出體內發生的事件。現在我們可以在小鼠模型中利用CRISPR。”

　　Moens說：“對于我們來說，CRISPR/Cas9讓靶向突變變得非常簡單。將之應用于非編碼序列是聰明之舉，它能夠起作用讓我感到驚喜。在原理上，這一想法與利用一種功能缺失方法來破壞調控元件而非基因自身是一樣的。”