流式細胞儀(FlowCytometry):鎦金歲月50年

　　自從50年前誕生至今，流式細胞儀（Flow cytometry）一直并仍然是無以倫比的高通量、高內涵的單細胞分析技術。

　　2015年11月，是流式細胞儀誕生50周年之時。人們可能會想象，一種如此長時間以前發明的技術應該到今天會是徹底地不同于當年，但是事實不然，它的基礎原理與結構幾乎沒有什么改變，這一點是令人吃驚的。它可以快速地同時分析在異質性混合物內的活細胞的多種參數，此混合物作為一種流體，在光子檢測器照射下產生圖像；這些參數整合在一起就得出了樣品的綜合圖像。流式細胞儀已經成為了一種主流的生物學研究工具、臨床診斷學手段，其應用已經帶來了數不勝數的免疫學和細胞生物學進展，并幫助人們認識了愛滋病和癌癥等疾病的本質。它已經推動了大量其它重大技術的研發，其用途還在持續擴展，范圍從單細胞分析到細胞群體分析。流式細胞儀是由一位電氣工程師馬克·福爾維勒（Mack Fulwyler）發明的，其初衷是出于對存在兩種紅血細胞群體的主張的爭論。當時，病理學家克拉倫斯·盧斯堡（Clarence Lushbaugh）正在使用一種測量懸浮顆粒多少和大小的儀器――庫特氏計數器（Coulter Counter）來鑒定紅血細胞的雙峰群體，福爾維勒提出其技術是不適當的。但是，對理論進行證偽的唯一途徑是建立一種儀器來在群體分析的基礎上物理地分離單個細胞。于是，細胞分選儀和流式細胞儀的構想就被提了出來。1964年，福爾維勒完成了對此發明的構思，并把想法寫信給了當時噴墨打印機的技術發明人理查德·斯威特（Richard Sweet）。其后10個月內，他們進行了合作，構思、設計、建立和成功檢測了一種細胞分選儀，并于1965年發表了有重大影響的開創性論文，對其原理進行闡述（見圖）。其概念和原理是非常新穎的，以致于整篇論文只有五篇參考文獻。

　　僅僅四年之后，該技術有了一次重大的進步。遺傳學家萊昂納德·漢森伯格（Leonard Herzenberg）使用并了解了這種細胞分選儀的威力。他與沃爾夫岡·哥德（Wolfgang Gohde）合作，將顯微鏡技術與流式細胞儀結合起來測量細胞關聯的熒光，這給細胞分析領域帶來了脫胎換骨的變化。其后不久，漢森伯格來到了劍橋大學的生物化學家凱撒·米爾斯坦（Cesar Milstein）實驗室度學術假，那時候米爾斯坦和喬治·科勒爾（Georges Kohler）發明了獲得諾貝爾獎的單克隆抗體技術。漢森伯格認識到，這些新的、特異性抗體可以用熒光染料進行標簽化處理，可以對異質性混合物內的細胞進行選擇性標記。他的實驗室很快就研發出了數十種單克隆技術來區分白血細胞的子集，從而建立起一份免疫細胞類型的字典。流式細胞儀不僅使得多參數數據得以收集，還使得細胞在存活的情況下，同一時間地分選成為不同的細胞群體，成為所謂的“熒光激活細胞分選”（FACS，fluorescence-activatedcell sorting）。

圖注：流式細胞儀原型.馬克·福爾維勒在1965年發表了第一臺流式細胞儀的構思圖，提出其可以“同時測量一個細胞的兩種（或者更多）特征，并根據這些特征的比例進行細胞分離。”

　　20世紀70年代中期，流式細胞儀進入了分子生物學領域，遺傳學家約瑟夫·格雷（Joseph Gray）研發出了流式染色體核型分型技術，可以在2分鐘內（而不是幾小時）評估出染色體的數量和外形來，還可以分選出單個的染色體來。該技術還擴展到了DNA和RNA內容物的研究，使之進入了細胞分裂周期分析和程序性細胞死亡（凋亡）的研究，在當時是全新的領域。更高內涵分析的持續驅動，促進了熒光染料的研發，如德克薩斯紅（后來成為了亞歷克斯染料）和花青染料，它們所形成的試劑市場目前已經超過了每年10億美元。便宜的紫色激光的出現，開始是一種低成本藍光光碟的副產品，后來形成了亮麗的紫色染料。量子點技術將光線轉換成為可見光譜系內差不多任何顏色，并保持高度的效率，目前也常見應用于流式分析中。能夠對每個細胞進行同時測量的數目，已經從20世紀70年代的1個或2個參數，增加到了今天的30個參數，這使得下一代高參數流式細胞儀競爭性地融合了細胞儀飛行時間技術（CyTOF）。2011年，CyTOF和質譜儀的結合形成了超高內涵流式細胞儀，其中，用金屬綴合探針對各種抗體進行標記。這種技術步驟更加復雜、通量不夠高，但是如同FACS一樣，其技術持續進化中。

　　今天，一系列分析化學及其儀器都被用于流式細胞儀中。測量的候選物包括干細胞和癌癥細胞的生物標記物、核酸、活性氧簇、微囊泡、甚至是酵母或細菌的功能狀態。可能該技術最引人注目的發展還是在其臨床細胞儀中。近來，在一些臨床實驗室中已經變得標準化的是同時用10種或更多種熒光染料進行操作，這種臨床市場大小現在超過了10億美元。

　　 用流式細胞儀進行細胞分選的工作已經長期地成為了生物醫學研究的一種核心工具，同時，它還很快地成為了其它生物學領域的一種標準技術。例如，在畜牧業中，它通過改進、被使用來分選精子以用于動物性別選擇，使動物配種形成一種全商業化的產業。在環境科學中，它已經被用來從復雜的微生物群落中分離以前不知道的生物體。流式細胞儀還在構建新的研究領域。它的大數據獲取能力打開了機會，可以建立基于高速度機器人和尖端分析化學的化學分析，并開發出群體分析的分類技術。作為一種財富和資源，數據的增長還支持對生物學過程的系統生物學認識，這形成了對尖端信息學發展的需求。事實上，目前對流式細胞儀的挑戰包括非常高內涵數據分析的標準化和與日俱增的復雜性。

　　今后的發展方向是怎樣的呢？下一代儀器現在能夠在細胞分選時得到非常高分辨率的細胞成像。還有基于聲學的分選，使用超聲輻射壓來集中細胞進入流體內，當樣品是低細胞濃度的時候可以得到令人滿意的結果。這一進步重新打開了在高速度條件下進行細胞周期分析的機會。光譜細胞計數儀（Spectral cytometry），應用全部的熒光發射譜系對每個細胞進行測量，得到獨特的細胞“指紋”，可以對熒光染料組合物的高度復雜混合物進行分離。拉曼散射流式細胞儀可以實時地根據細胞的化學狀態對細胞進行分選。大量的在微型化和微流體學方面的努力也在進行之中，這方面的改進目標是為了無菌條件下進行（細胞）移植而進行高通量細胞分選。極端高通量的基于微流體學的細胞分選將預示著50年發展史中基礎硬件的第一個重大革命。目前在流體細胞儀市場上有100多家公司，組成了超過30億美元規模的產業。流體細胞儀普遍應用于研究和臨床醫學領域，這項技術在生物學醫學領域的應用是任何其它技術無法媲美的。流式細胞儀50年的發展史證明，吹盡黃沙始到金，流式細胞儀，貨真價實地是好東西。

　　注：原文作者J.保羅·羅賓遜（J. Paul Robinson）是美國普渡大學韋爾登生物醫學工程學院基礎醫學科學系主任，馬瑞歐·羅伊德勒（Mario Roederer）供職于美國國立衛生研究院國立變態反應與傳染病研究所疫苗研究中心。