質譜沙龍第三十期活動報道

　　2011年3月27日，第三十期質譜沙龍活動在第二炮兵總醫院藥學部成功舉行。來自第二炮兵總醫院、空軍總醫院、解放軍第309醫院、北京安貞醫院、北京大學醫學部AB SCIEX公司、天津博納艾杰爾科技有限公司、北京艾米諾醫學研究有限公司、美東生物(AOBO)公司等二十余位專家、學者、技術工程師等參加了本次沙龍活動。

第三十期質譜沙龍活動現場

質譜沙龍回顧及展望、LC-MS/MS定量分析中的幾個問題探討

　　解放軍第二炮兵總醫院李鵬飛老師主持沙龍活動并作了題為《質譜沙龍回顧及展望、LC-MS/MS定量分析中的幾個問題探討》報告，首先回顧了質譜沙龍活動三年多來所開展的工作，規劃了今年的活動安排，展望了質譜沙龍的美好前景;而后，李老師重點介紹了他在分析研究中遇到的幾個問題，與大家一起分享、討論了他的做法和見解。

解放軍第二炮兵總醫院 李鵬飛 老師

　　質譜沙龍活動回顧與展望

　　質譜沙龍活動自2007年9月發起，由第二炮兵總醫院藥學部主辦，北京師范大學分析測試中心、AB SCIEX公司、艾米諾醫學研究有限公司等協辦。沙龍的宗旨是構建有機質譜一線使用人員交流平臺，堅持無償公益的原則。質譜沙龍活動主要以專題報告和實際問題自由交流的形式為主，29期的百余篇專題報告以小分子化合物、大分子蛋白、中藥單體/組方等為研究對象，介紹了藥物研發、臨床藥代、食品安全、中毒監測等應用方向及其LC/MS新技術、新方法等。

　　2011年度質譜沙龍規劃與展望：計劃5期質譜沙龍活動，每兩月舉行一次;小分子定量質譜實驗室多中心室間質評;從四本有關質譜及其應用的英文書籍中選擇一本進行翻譯;6月中旬舉辦第二屆質譜沙龍聯誼會;推出沙龍總結及專家團隊介紹彩頁，加強宣傳和交流;進一步完善管理團隊、專家團隊、一線報告團隊和組織團隊，加強管理、走向正規。希望更多的朋友能參與進來，提供更高、更好、更貼近實際的報告，集思廣益，把質譜沙龍建成一個更自由、更活躍、更高層次的交流平臺。

　　LC-MS/MS定量分析中的幾個問題探討

　　李老師首先講了雷奈酸和雷奈酸鍶的問題。雷奈酸鍶是治療骨質疏松的一個藥物，主要是鍶在起作用，雷奈酸和鍶結合后容易進入到人體內。對于雷奈酸和雷奈酸鍶，臨床藥代實驗都是要做的，鍶建議采用無機質譜做，如ICP-MS等，雷奈酸用液質做。經過前期實驗，李老師發現不管是正離子掃描還是負離子掃描，在預定的位置都沒有出峰，添加離子化試劑，也沒有峰出現。雷奈酸有四個羧基，有個氰基，還有個硫，按道理應該有峰出現，為什么就沒有質譜峰出現?后來李老師通過原創方法，優化色譜條件，得到一個比較漂亮的譜圖。分析驗證，能夠滿足臨床藥代的需求。李老師說這個問題是想告訴大家，當用常規質譜方法不能奏效時，就要換個思路，如試試氣質、液相、熒光、衍生化等方法。

　　鍶是無機元素，在環境中肯定會存在，在體內也會存在。在空白和本底里都有鍶的存的，那么測完之后的評價就是一個難題，要用空白添加法的話，標準曲線就沒辦法做。給完藥后不同時間點測的結果減掉零點空白合適嗎?我給藥后可能采樣持續一周，這中間吃飯也可能有鍶進入體內，這時鍶的濃度可能就會升高，都是有影響的。李老師查了這方面的相關文獻報道，一些老師做的鉀、鈉等，同樣有這個問題。減這個點到底怎樣減，是減空白值，還是減平衡值，拿平衡值減甚至可能減出負數來，還有坐標曲線都不好做。是用空白點去做，還是用溶液的曲線去做，或是先拿溶液把量定出來，再加上空白等等，這些都和常規的藥代是有區別的，我提出這個問題供大家來討論。我采用空白添加法做這個曲線，然后用這個曲線的響應值減去空白曲線的響應值，得到的曲線完全就是加進去藥的曲線，實際樣本測出來后，對應的點單減去空白。不同的人有不同的做法，這本身就是一個很爭議的問題。

　　接著，李老師又講了一個氯吡格雷的問題。氯吡格雷是一種前體藥，氯吡格雷經氧化生成2-氧基-氯吡格雷，繼水解形成活性代謝物(一種硫醇衍生物)，約占約15%左右;另外還有一種非活性代謝物羧酸鹽衍生物，約占85%，剩下的氯吡格雷1%左右。對三個對照品都做是最好的，其中氯吡格雷和羧酸鹽衍生物比較容易檢測，故篩選其中兩個去做。當給藥是75mg時，體內羧酸鹽衍生物是3000ng;當給藥是150mg時，體內氯吡格雷是2ng，兩者懸殊3000倍。高通量質譜可以同時做，但有點勉強，最后選擇了分開做。高濃度稀釋后做，非活性濃度特別高，采用一個短柱做，六七百個藥物兩三天就做完了;濃度低用梯度方法做，而且響應值也做的很好，這樣既不用很勉強去做，也能很快做完。

　　最后，李老師介紹了免疫抑制劑環孢素A。環孢素A是臨床移植等用的藥物，這種藥物需要現場監測，因為它用藥范圍非常窄，高點或低點都會有問題，低了免疫性能丟失。采用博納艾杰爾的蛋白沉淀板，是個很簡便的方法，將樣品上到板上，然后給一個渦流負壓抽過去，就可以直接上質譜檢測了。李老師分別對HPLC-MS/MS法和TDx分析方法測定全血中環孢素A及MAS沉淀板與蛋白沉淀質譜法測定全血中環孢素A進行了比較。最后得出的結果比較：HPLC-MS/MS法約是TDx的55%，MAS沉淀板法稍微比蛋白沉淀質譜法高7～8%左右，不論哪種方法都有穩定的比值。

I期臨床實驗室簡介及工作中的問題探討

　　北京安貞醫院藥物臨床試驗機構李靜老師作了題為《I期臨床實驗室簡介及工作中的問題探討》的報告，介紹了I期臨床實驗室的相關情況，與大家一起探討了在工作中如何解決基質效應問題、污染問題等。

北京安貞醫院藥物臨床試驗機構 李靜 老師

　　I期臨床實驗室簡介

　　藥物臨床試驗機構于2006年9月12日通過國家藥監局的資格認定，I期臨床實驗室簡介設有精密儀器室、實驗準備室(樣品處理室)、離心機室等。實驗室有Agilent 1100高效液相色譜儀、3200 QTRAP質譜儀、WaterPro PS/HPLC純水器、Sigma 低溫高速/低溫低速離心機、精密電子天平、低溫冰箱等主要一起設備，并配有Agilent 固相萃取儀、氮氣吹干儀、奧利龍pH計、恒溫培養振蕩器和精密加樣器等小型配套儀器，還有DAS、WinNonlin、SPSS、SAS等數據處理工具。

　　解決基質效應問題

　　關于基質效應的問題，李老師以新型二氫吡啶類鈣通道阻滯劑為例，該類化合物化學性質不穩定，見光易分解。實驗時加入尼莫地平為內標，樣品前處理用蛋白沉淀法，采用ESI源質譜和Agilent Extend-C18色譜柱。上述條件方法考察5天，準確度與精密度、穩定性等考核均符合要求;15天后臨床生物樣本采集完畢，開始測定后發現測定完一批生物樣本后質控樣本測定不合格，被測物和內標響應均降低。

　　那該怎樣克服基質效應的影響?一般方法是：改變被測物的色譜分離條件;選擇合適的樣品預處理方法，考慮沉淀蛋白法雖提取藥物效率高，但同時也引入很多看不見的雜質，故樣本前處理改用液液萃取法;穩定同位素內標;采用小樣進量，約為10μl;利用液相色譜電解質效用。

　　解決污染問題

　　接下來，李老師向大家介紹了實驗中應如何避免污染問題及注意事項。樣品處理過程中怎樣避免工作液配制污染，氮吹儀、加樣槍頭及加樣過程引入的污染?注意操作臺面清潔，手套污染及時更換或勤洗手;氮吹儀吹干時盡量不要讓針孔伸到溶液液面之下，氣流緩慢增大;加樣時要從低濃度向高濃度操作。樣品測定過程中怎樣避免洗針液、流動相和進樣器六通閥的污染?及時清洗試劑瓶，更換新溶液;規范洗針程序。接著，李老師又談到了實驗中要注意的幾個事項：精密儀器日常維護(機器除塵、控制室內溫濕度、氣體供應是否充足、更換泵油等)，儀器定期進行校準檢驗，咨詢專業人士和詳細記錄遇到的問題等。

　　最后，李老師提出了生物樣本存儲時間，生物樣本儲存期滿后的處理方式，脈沖梯度色譜技術和液相色譜電解質效應等四個問題，供大家討論。

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血斑(DRIED BLOOD SPOT,DBS)LC-MS/MS分析進展

　　AB SCIEX公司市場研究部經理彭立新博士作了題為《血斑(DRTED BLOOD SPOT,DBS)LC-MS/MS分析的進展》的報告，介紹了DBS分析的基礎知識、優缺點，以及DBS液質分析法在生物醫藥領域的應用實例。

AB SCIEX公司市場研究部經理 彭立新 博士

　　血斑分析在40年前就已經存在了，最早用于臨床實驗，不需要精確的定量分析，現在主要用于新生兒和一些免疫系統缺陷疾病的篩查。

　　DBS技術分析特點

　　DBS分析的優點：操作方便，樣品體積小，降低樣品運輸和存儲成本。更重要的是能在臨床前期實驗中減少動物用量，這是醫藥公司尤其看重的。另外，采血量少，病人更容易接受，特別適合兒科。樣品不需冷凍，穩定性好。

　　DBS分析也存在局限性，由于樣品容量小，需要檢測技術靈敏度高;同時，手工操作，工作量大，這兩點制約了DBS分析方法的發展。這就需要液相色譜、質譜來助航。

　　血斑的LC-MS/MS分析

　　液質聯用的出現，提高了血斑分析的靈敏度，可進行定量分析，誤差小于15%，使血斑分析越來越來越熱門。

　　AB SCIEX QTRAP 5500 LC/MS/MS系統是目前世界上最高性能的高端液質聯用串聯質譜系列。5500本身就能滿足DBS檢測靈敏度的需要， QTRAP 5500 能進一步消除基質效應。與Turbo V?離子源和MultiQuant軟件連用可進行批量分析。另外，API 500和三重四極桿5500也完全能滿足DBS分析要求的ng/ml級靈敏度。

　　使用QTRAP5500系統和先進的MultiQuant分析軟件，LC-MS/MS分析方法速度快、靈敏度高，在DBS分析領域迅速發展，在布德松和氟替卡松丙鹽酸測量方面取得了很大進展。選擇不同紙板，增加血片直徑等方法，可以提高樣品容量。隨著色譜、質譜等儀器和DBS技術本身的不斷發展，不僅只可以做血斑還可以用于類似體液類樣品的定量分析。彭老師通過幾個實例詳細介紹了不同樣品的定量分析，如使用5500 LC/MS/MS，采用DBS方法可以定量分析氟康唑，采用DMS方法可定量分析眼淚中的妥布拉霉素等。

　　最后，彭老師總結說：DBS技術的準確度和精度能夠滿足做生化分析的要求，另外它是現在生化樣品分析工具的一個補充，最重要的是它可以節省很多樣品制備的費用。據預測，DBS技術未來將占據25%～50%的市場份額，隨著質譜技術和DBS接口的技術越來越成熟，將會有更大的發展前途。

“二分五性三碼一譜”新策略探索解決體內藥物分析中存在的或然問題

　　空軍總醫院藥學部的梁貴健老師作了題為《“二分五性三碼一譜”新策略探索解決體內藥物分析中存在的或然問題》的報告，分別從提出的背景、內涵意義和作用、實例等方面介紹了“二分五性三碼一譜”新策略在解決體內藥物分析中存在的或然性方面的探索。

空軍總醫院藥學部的 梁貴健 老師

　　藥物色譜分析方法現狀

　　色譜分離條件的優化是色譜分析應用中面臨的主要問題，分子結構參數與其保留值的預測一直是色譜學家追求的目標。盡管國內外在上述領域做了大量工作，但面對結構復雜多樣的藥物，其應用結果卻大多難以令人接受。

　　目前建立藥物色譜分析方法仍處于反復摸索的偶然或然狀態，或借助單純形、窗口圖法、重疊分辨率法和均勻設計等優化方法。與其緊密相關的基礎性問題，至今未得到系統的研究。

　　在生物樣品分析中，如何避開內源物、臨床聯合用藥和代謝產物對被測物的干擾，對于選擇良好的色譜條件、預處理條件和優化內標物至關重要。要解決這樣的問題，必須全面掌握內源性物質和常用藥物的色譜行為以及預處理后被除去、純化和富集的數據和規律。目前在這一領域的研究多為“就藥測藥”的應用性研究，還沒有一個基于實驗數值型數據庫或能對流動相組成、內標選擇和樣品預處理方法三者進行推薦和仿真模擬的專家系統。

　　“二分五性三碼一譜”

　　“二分”從分析樣品性質上區分是藥品分析還是生物藥物分析，從藥物結構上分清被測藥物的酸堿性。“五性”即色譜性、檢測性(響應性)、穩定性、回收性和商品性。“三碼”即色譜碼、檢測碼和回收碼。“一譜”即內源性干擾三維碼。二分定原則，五行選藥物，三碼找方法，一譜除干擾。

　　以HPLC-PDA-MS為測試手段，通過統一規范操作和計算機信息技術，創建高具有可比性的百種藥物的色譜碼、檢測碼和人血樣品預處理回收碼及去內源性干擾三維譜數據庫，開創在網絡上進行在線或離線指導快速建立穩健的HPLC藥物分析方法的先例，解決流動相、內標和預處理三項試驗方法優化的或然性瓶頸問題。

　　幾個重要問題

　　梁老師還就實驗中遇到的幾個重要問題與大家進行了交流。

　　首先是內標，通過測試發現了一些光譜吸收區域寬、色譜行為優良和穩定性好的藥物，有望充當常用內標物。并且通過實驗總結出了20多種內標選擇規則。接下來從內標的加入程序、內標被測物的相容性、內標來源和方法等方面進一步闡述了建立可推廣的內標選擇方法。

　　其次簡單介紹了pH值4-5雙突躍現象、在測量pH值時如何盡量減少誤差，以及關于回收率的問題。

　　最后，梁老師對“二分五性三碼一譜”新策略目前取得的成果和存在的問題進行了總結。